Nouveaux outils de détection et d’ analyse
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de quelques centaines voire de milliers de paires de bases et d’en réaliser l’amplification en PCR quantitative (qPCR). La présence de dommages provoque un
retard de PCR qui est visualisé en comparant un échantillon traité et un témoin.
Cette technique est utilisable pour les dommages bloquant la polymérase ou ceux
pouvant être convertis en coupure avant PCR. La PCR peut également être utilisée
pour quantifier les dommages au sein d’un gène par « ligation mediated PCR »
(LMPCR). Les dommages sont convertis en cassures puis les fragments ainsi
générés sont amplifiés après accroche d’une séquence reconnue par les amorces.
Les avantages de cette méthode résident dans la rapidité du test pour la qPCR et
la mesure des lésions au nucléotide près dans la séquence par LMPCR. Elles sont
malheureusement peu sensibles.
1.1.1.4. Electrophorèse en champ pulsé
L’électrophorèse d’ADN isolé a été pendant longtemps le seul moyen d’aborder
la question de la formation des cassures double brin dans des ADN génomiques
complexes, comme l’ADN de cellules eucaryotes. La modification alternative de
la polarité du champ électrique au cours du temps, et les réorientations qu’elle
induit pour les fragments d’ADN, permettent une séparation des molécules
d’ADN complexes en fonction de leur taille (50 kb à quelques megabases). L’électrophorèse en champ pulsé a ainsi notamment permis de mesurer la quantité
initiale des cassures double-brin cellulaires créées par le rayonnement ionisant
(Ruiz de Almodovar et al., 1994).
Son utilisation dans le domaine de la toxicologie est cependant limitée par le
lait que sa sensibilité est insuffisante pour la plupart des applications, notamment si l’on s’intéresse à la quantification de la réparation des cassures double
brin. Cette méthode est peu à peu abandonnée au profit de la mesure de l’histone
YH2AX, marqueur récemment identifié de la présence de cassures double brin.
l‘l‘2. Activités de réparation
La mesure d’activités de réparation peut être yd'^^est"^
d’exposition à un agent génotoxique, comme c est e ca
également
. non programmée de l’ADN. Cette mesure
blés d^poUntiaLr l’acç servir à détecter des inhibiteurs de la reparation
P
» tion mutagène de substances génotoxiques.
•0
w
I 1.1.2.1. Test de synthèse non programmée de l’ ADN
|
Ce test réglementaire, réalisé sur des cellules ^vantes, ^xcl^
substances
? en phase S de crorssance, permet d identr
„vnthxse d’ADN correspondant
l potentiellement génotoxiques. Ce.
excision et à l’éliminaa la réparation des lésrons et qui tait de
traitées sont incubées en
j -ion d’un fragment d’ADN. Classiquement tes cellules ira^.æ
3 presence de thymidine tritiée et les grains,
nlitoradiographie. Le test
9 Pondent aux foyers de réparation, sont comptes ap
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de quelques centaines voire de milliers de paires de bases et d’en réaliser l’amplification en PCR quantitative (qPCR). La présence de dommages provoque un
retard de PCR qui est visualisé en comparant un échantillon traité et un témoin.
Cette technique est utilisable pour les dommages bloquant la polymérase ou ceux
pouvant être convertis en coupure avant PCR. La PCR peut également être utilisée
pour quantifier les dommages au sein d’un gène par « ligation mediated PCR »
(LMPCR). Les dommages sont convertis en cassures puis les fragments ainsi
générés sont amplifiés après accroche d’une séquence reconnue par les amorces.
Les avantages de cette méthode résident dans la rapidité du test pour la qPCR et
la mesure des lésions au nucléotide près dans la séquence par LMPCR. Elles sont
malheureusement peu sensibles.
1.1.1.4. Electrophorèse en champ pulsé
L’électrophorèse d’ADN isolé a été pendant longtemps le seul moyen d’aborder
la question de la formation des cassures double brin dans des ADN génomiques
complexes, comme l’ADN de cellules eucaryotes. La modification alternative de
la polarité du champ électrique au cours du temps, et les réorientations qu’elle
induit pour les fragments d’ADN, permettent une séparation des molécules
d’ADN complexes en fonction de leur taille (50 kb à quelques megabases). L’électrophorèse en champ pulsé a ainsi notamment permis de mesurer la quantité
initiale des cassures double-brin cellulaires créées par le rayonnement ionisant
(Ruiz de Almodovar et al., 1994).
Son utilisation dans le domaine de la toxicologie est cependant limitée par le
lait que sa sensibilité est insuffisante pour la plupart des applications, notamment si l’on s’intéresse à la quantification de la réparation des cassures double
brin. Cette méthode est peu à peu abandonnée au profit de la mesure de l’histone
YH2AX, marqueur récemment identifié de la présence de cassures double brin.
l‘l‘2. Activités de réparation
La mesure d’activités de réparation peut être yd'^^est"^
d’exposition à un agent génotoxique, comme c est e ca
également
. non programmée de l’ADN. Cette mesure
blés d^poUntiaLr l’acç servir à détecter des inhibiteurs de la reparation
P
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I 1.1.2.1. Test de synthèse non programmée de l’ ADN
|
Ce test réglementaire, réalisé sur des cellules ^vantes, ^xcl^
substances
? en phase S de crorssance, permet d identr
„vnthxse d’ADN correspondant
l potentiellement génotoxiques. Ce.
excision et à l’éliminaa la réparation des lésrons et qui tait de
traitées sont incubées en
j -ion d’un fragment d’ADN. Classiquement tes cellules ira^.æ
3 presence de thymidine tritiée et les grains,
nlitoradiographie. Le test
9 Pondent aux foyers de réparation, sont comptes ap