200
Toxicologie nucléaire environnementale et
hors de son site de liaison. La force de rupture dépend de la vitesse de charge
appliquée sur la liaison. Les modèles cinétiques reliant la force de rupture d’une
liaison protéine-ligand (spectroscopie dynamique de force, DFS) aux paramètres
thermodynamiques sont parfaitement adaptés à la caractérisation du paysage
énergétique d’une interaction protéine-métal (Teulon, 2008).
L’AFM utilise des leviers de quelques millimètres auxquels est attachée une
fine poutre de quelques centaines de micron de long. Un des partenaires de
l’interaction est fixé sur la poutre (mais aussi sur le levier) et l’autre est déposé sur
une surface plane d’or ou de mica. Le levier se déplace dans les trois directions
de l’espace sous l’action d’un jeu de tubes piézoélectriques qui permettent un
déplacement dans un plan X-Y avec une précision de l’ordre du nm et dans l’axe
Z avec une précision de l’ordre de l’angstrôm. On réalise des expériences de
force-distance qui consistent à approcher verticalement la pointe de la surface
puis à retirer le levier verticalement à une vitesse constante. Lorsque le ligand
fixé sous le levier entre en contact avec le partenaire placé sur le substrat plan,
1 interaction provoque une déflection du levier détectée au moyen d’un système
optique mettant en jeu un rayon laser incident. Toute modification de l’angle de
réflexion est enregistrée par un système de photodiodes. À une certaine distance
d étirement (x), la liaison cède. La force dite de rupture de liaison est liée à h
constante de raideur du levier (k) par la relation F = kx. Puisque l’on travaille au
niveau de la molécule unique, il est nécessaire de répéter ces mesures plusieurs
milliers de fois pour obtenir de bonnes statistiques de ruptures.
1.3.
1.3.1.
Autres méthodes biophysiques
La microcalorimétrie
quantité de chaleur consommé °rin^rie Permettent de mesurer directement la
par les protéines à l’état libre pG
1
'ors de changements structuraux subis
d’enthalpie (AH) d’un svstèmp”S°Utlon- La détermination directe de la variation
par aucune autre technique D
Uant Un ^tat défini à un autre n’est possible
ragan, 2007).
eux niethodes d’analyse sont utilisées (Privalov et
calorimetry) permet^dTauamif11161^116 isotherme ou ITC (isothermal titration i
successifs d’un ligand à une c Tr & c^a’eur absorbée ou dégagée lors d’ajouts ;
miner de façon très précise h ° U 'On P,otéique. Cette mesure permet de déter- ;
reaction (n), et l’entropie de la COnstante de liaison (Ka), la stœchiométrie de la i
sarov, 2007). Cependant dans Ip^ ’T* ^S0) (Wilcox, 2008; Okrimenko et Jele- j
P us complexe en raison des no
GS 1Tætaux l’analyse des données est rendue ;
egagement de chaleur lors dp
phénomènes qui peuvent participer à ce j
10n e protéine : oxydoréductinn3 ' Utl°n
solution métallique dans la solu-1
ornP exes avec le tampon n Precipitation, hydrolyse, formation de nouveaux -
°Uyent Par un déplacement dp £ merne’ *a liaison métal-protéine se traduit •
ayse fine des résultats est dn^0*008’ modifiant l’équilibre du système.
j
necessaire pour déterminer l’énergie libre et
Toxicologie nucléaire environnementale et
hors de son site de liaison. La force de rupture dépend de la vitesse de charge
appliquée sur la liaison. Les modèles cinétiques reliant la force de rupture d’une
liaison protéine-ligand (spectroscopie dynamique de force, DFS) aux paramètres
thermodynamiques sont parfaitement adaptés à la caractérisation du paysage
énergétique d’une interaction protéine-métal (Teulon, 2008).
L’AFM utilise des leviers de quelques millimètres auxquels est attachée une
fine poutre de quelques centaines de micron de long. Un des partenaires de
l’interaction est fixé sur la poutre (mais aussi sur le levier) et l’autre est déposé sur
une surface plane d’or ou de mica. Le levier se déplace dans les trois directions
de l’espace sous l’action d’un jeu de tubes piézoélectriques qui permettent un
déplacement dans un plan X-Y avec une précision de l’ordre du nm et dans l’axe
Z avec une précision de l’ordre de l’angstrôm. On réalise des expériences de
force-distance qui consistent à approcher verticalement la pointe de la surface
puis à retirer le levier verticalement à une vitesse constante. Lorsque le ligand
fixé sous le levier entre en contact avec le partenaire placé sur le substrat plan,
1 interaction provoque une déflection du levier détectée au moyen d’un système
optique mettant en jeu un rayon laser incident. Toute modification de l’angle de
réflexion est enregistrée par un système de photodiodes. À une certaine distance
d étirement (x), la liaison cède. La force dite de rupture de liaison est liée à h
constante de raideur du levier (k) par la relation F = kx. Puisque l’on travaille au
niveau de la molécule unique, il est nécessaire de répéter ces mesures plusieurs
milliers de fois pour obtenir de bonnes statistiques de ruptures.
1.3.
1.3.1.
Autres méthodes biophysiques
La microcalorimétrie
quantité de chaleur consommé °rin^rie Permettent de mesurer directement la
par les protéines à l’état libre pG
1
'ors de changements structuraux subis
d’enthalpie (AH) d’un svstèmp”S°Utlon- La détermination directe de la variation
par aucune autre technique D
Uant Un ^tat défini à un autre n’est possible
ragan, 2007).
eux niethodes d’analyse sont utilisées (Privalov et
calorimetry) permet^dTauamif11161^116 isotherme ou ITC (isothermal titration i
successifs d’un ligand à une c Tr & c^a’eur absorbée ou dégagée lors d’ajouts ;
miner de façon très précise h ° U 'On P,otéique. Cette mesure permet de déter- ;
reaction (n), et l’entropie de la COnstante de liaison (Ka), la stœchiométrie de la i
sarov, 2007). Cependant dans Ip^ ’T* ^S0) (Wilcox, 2008; Okrimenko et Jele- j
P us complexe en raison des no
GS 1Tætaux l’analyse des données est rendue ;
egagement de chaleur lors dp
phénomènes qui peuvent participer à ce j
10n e protéine : oxydoréductinn3 ' Utl°n
solution métallique dans la solu-1
ornP exes avec le tampon n Precipitation, hydrolyse, formation de nouveaux -
°Uyent Par un déplacement dp £ merne’ *a liaison métal-protéine se traduit •
ayse fine des résultats est dn^0*008’ modifiant l’équilibre du système.
j
necessaire pour déterminer l’énergie libre et