Biologie structurale des interactions entre protéines et éléments d’intérêt
199
peut être complétée par l’analyse des propriétés des vibrations métal-ligand, qui
contribuent dans le domaine IR lointain (650-50 cm-'). Ce domaine est longtemps
resté inaccessible pour des raisons techniques et à cause de la faible amplitude des
bandes IR. L’utilisation de la spectroscopie IR en mode différentiel se développe
dans ce domaine par photochimie (Chu et al., 2000) et électrochimie (Marboutin
et al., 2009) et devrait permettre d’analyser finement les forces d’interaction
métal-ligand qui régissent notamment l’affinité des sites métalliques.
1.2.3. La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse est une technique de choix pour l’identification
d’interactions protéine-métal. Couplée à l’ICP (inductively coupled plasma), elle
permet d’identifier la nature des métaux associés à une protéine. La forte sensibilité
de cette technique permet d’analyser de faibles quantités de protéine. Le couplage
de techniques séparatives (telles que la chromatographie liquide, l’électrophorèse
capillaire, ou la séparation de protéines sur des gels d’acrylamide) et de l’ICP-MS
permet d’identifier les protéines fixant les métaux dans un mélange complexe
comme un extrait cellulaire. Ces approches ont permis récemment d’identifier
la présence de sélénoprotéines dans des extraits cellulaires, suite à l’exposition
des cellules à de fortes concentrations de sélénium (Ballihaut et al., 2007) ou de
définir le rôle de la nicotianamine dans la complexation du nickel chez une plante
hyperaccumulatrice de métaux, Thlaspi caerulescens (Vacchina et al., 2003). Le
couplage en parallèle de l’analyse des fractions protéiques séparées par chromatographie liquide par l’ICP-MS d’une part, et par spectrométrie de masse en mode
MALDI ou electrospray (ESI-MS) d’autre part, permet pour un temps de rétention
donné, i.e. pour une protéine donnée, d’identifier à la fois la présence de métal (par
ICP-MS) en interaction avec la protéine et la nature de la protéine qui fixe le métal
(par ESI-MS) (Lobinski et al., 2006). Enfin, l’utilisation de méthodes douces d’ionisation des protéines permet de conserver des interactions non covalentes comme
les interactions protéine-métal lors de l’analyse par spectrométrie de masse. Ces
techniques sont délicates à mettre en oeuvre mais peuvent permettre d’identifier
la stœchiométrie métal-protéine, la nature des métaux fixés sur la protéine ainsi
que des aspects dynamiques des interactions protéine-métal (Kaltashov et al.,
2006). La modification chimique de certains acides aminés potentiellement ligands
(notamment les cystéines), en présence et en absence de métal, suivie d’une étude
fine de la protéine par fragmentation par des approches MS-MS, permet également
d’identifier les résidus de la protéine impliqués dans la fixation du métal (Gonzales
de Peredo et al., 1999 ; Kaltashov et al., 2006).
L2.4. La spectroscopie dynamique de force
Le paramètre thermodynamique décrivant l’affinité d’un métal pour sa protéine
est sa constante cinétique de dissociation. Pour déterminer les paramètres cinétiques de l’interaction protéine-métal, il est possible d’utiliser une approche basée
sur la microscopie à force atomique (AFM). L’AFM est utilisée pour mesurer la
force de liaison entre un ligand et un récepteur (ici une protéine) en tirant le ligand
199
peut être complétée par l’analyse des propriétés des vibrations métal-ligand, qui
contribuent dans le domaine IR lointain (650-50 cm-'). Ce domaine est longtemps
resté inaccessible pour des raisons techniques et à cause de la faible amplitude des
bandes IR. L’utilisation de la spectroscopie IR en mode différentiel se développe
dans ce domaine par photochimie (Chu et al., 2000) et électrochimie (Marboutin
et al., 2009) et devrait permettre d’analyser finement les forces d’interaction
métal-ligand qui régissent notamment l’affinité des sites métalliques.
1.2.3. La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse est une technique de choix pour l’identification
d’interactions protéine-métal. Couplée à l’ICP (inductively coupled plasma), elle
permet d’identifier la nature des métaux associés à une protéine. La forte sensibilité
de cette technique permet d’analyser de faibles quantités de protéine. Le couplage
de techniques séparatives (telles que la chromatographie liquide, l’électrophorèse
capillaire, ou la séparation de protéines sur des gels d’acrylamide) et de l’ICP-MS
permet d’identifier les protéines fixant les métaux dans un mélange complexe
comme un extrait cellulaire. Ces approches ont permis récemment d’identifier
la présence de sélénoprotéines dans des extraits cellulaires, suite à l’exposition
des cellules à de fortes concentrations de sélénium (Ballihaut et al., 2007) ou de
définir le rôle de la nicotianamine dans la complexation du nickel chez une plante
hyperaccumulatrice de métaux, Thlaspi caerulescens (Vacchina et al., 2003). Le
couplage en parallèle de l’analyse des fractions protéiques séparées par chromatographie liquide par l’ICP-MS d’une part, et par spectrométrie de masse en mode
MALDI ou electrospray (ESI-MS) d’autre part, permet pour un temps de rétention
donné, i.e. pour une protéine donnée, d’identifier à la fois la présence de métal (par
ICP-MS) en interaction avec la protéine et la nature de la protéine qui fixe le métal
(par ESI-MS) (Lobinski et al., 2006). Enfin, l’utilisation de méthodes douces d’ionisation des protéines permet de conserver des interactions non covalentes comme
les interactions protéine-métal lors de l’analyse par spectrométrie de masse. Ces
techniques sont délicates à mettre en oeuvre mais peuvent permettre d’identifier
la stœchiométrie métal-protéine, la nature des métaux fixés sur la protéine ainsi
que des aspects dynamiques des interactions protéine-métal (Kaltashov et al.,
2006). La modification chimique de certains acides aminés potentiellement ligands
(notamment les cystéines), en présence et en absence de métal, suivie d’une étude
fine de la protéine par fragmentation par des approches MS-MS, permet également
d’identifier les résidus de la protéine impliqués dans la fixation du métal (Gonzales
de Peredo et al., 1999 ; Kaltashov et al., 2006).
L2.4. La spectroscopie dynamique de force
Le paramètre thermodynamique décrivant l’affinité d’un métal pour sa protéine
est sa constante cinétique de dissociation. Pour déterminer les paramètres cinétiques de l’interaction protéine-métal, il est possible d’utiliser une approche basée
sur la microscopie à force atomique (AFM). L’AFM est utilisée pour mesurer la
force de liaison entre un ligand et un récepteur (ici une protéine) en tirant le ligand