CHLOROPHYLLE - FLUOR1MÉTRIE
7 4.1. Etalonnage à partir d’une culture d’algues
Cette méthode introduit des erreurs car l’étalonnage effectué avec des
Diatomées (ou Chrysophycées) détermine une constante (Fo/FA) max (§ 8)
qui est surestimée par rapport à celle correspondant à la chlorophylle u;
inversement, un étalonnage utilisant une Chlorophycée entraîne une sousestimation de cette constante. Ceci est en liaison avec la présence, soit de
chlorophylle c (Diatomées, Chrysophycées), soit de chlorophylle b (Chlorophycées) comme pigment accessoire.
Dosage spectrophotométrique de la concentration en chlorophylle a de l’étalon.
• Réaliser un extrait acétonique de l’algue en culture, en suivant le processus précédemment décrit.
• Mesurer l’absorbance de l’extrait sur un spectrophotomètre bien calé
en longueur d’onde, à 664 et 630 nm. Elle doit être comprise entre 0,1
et 0,8 à 664 nm, avec une cuve de 1 cm de trajet optique. Dans le cas
d’une turbidité à 750 nm, soustraire la valeur trouvée des absorbances
à 664 et 630 nm.
• Calculer les concentrations d’après Jeffrey et Humphrey (1975), soit
pour les Diatomées et Chrysophycées :
[Chlorophille a](mg.l-1) = 11,47A664 - 0.40 A63o .
Détermination des constantes (Kx) de calibration du fluorimètre et de (Fq/Fa) max.
• Réaliser une gamme de dilutions à partir de l’étalon.
• Mesurer la fluorescence Fo ; il faut trois points de mesure pour chacune
des fentes du fluorimètre. On obtient ainsi pour chaque fente :
[Chlorophylle a] = Kx x Fluorescence .
• (Fq/Fa) max est obtenu par acidification puisque la solution mère est
supposée ne pas contenir de phéopigments.
• S’assurer par la méthode spectrophotométrique de Lorenzen (1967)
que le rapport des absorbances avant et après acidification à 665 nm
indique bien une absence de phéopigment.
La stabilité de réponse du fluorimètre turner 111 est bonne : deux étalonnages par an en principe suffisent ; toutefois, il faut refaire l'étalonnage
à chaque modification de l’appareillage : lampe, photomultiplicateur, filtres
optiques.
7.4.2. Etalonnage avec de la chlorophylle a du commerce (sigma)
Plusieurs laboratoires utilisent cette solution pour leur étalonnage.
• Mettre la chlorophylle a en solution dans l’acétone à 90 %.
• Déterminer la concentration en chlorophylle de cette solution par spectrophotométrie comme suit : mesurer l’absorbance à 664 nm (1 cm de
trajet optique) qui doit être comprise entre 0,1 et 0,8 et calculer la concentration à l’aide du coefficient d’absorption spécifique déterminé par
Jeffrey et Humphrey (1975) :
A
[Chlorophylle a] (mg.l-1) =
•
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7 4.1. Etalonnage à partir d’une culture d’algues
Cette méthode introduit des erreurs car l’étalonnage effectué avec des
Diatomées (ou Chrysophycées) détermine une constante (Fo/FA) max (§ 8)
qui est surestimée par rapport à celle correspondant à la chlorophylle u;
inversement, un étalonnage utilisant une Chlorophycée entraîne une sousestimation de cette constante. Ceci est en liaison avec la présence, soit de
chlorophylle c (Diatomées, Chrysophycées), soit de chlorophylle b (Chlorophycées) comme pigment accessoire.
Dosage spectrophotométrique de la concentration en chlorophylle a de l’étalon.
• Réaliser un extrait acétonique de l’algue en culture, en suivant le processus précédemment décrit.
• Mesurer l’absorbance de l’extrait sur un spectrophotomètre bien calé
en longueur d’onde, à 664 et 630 nm. Elle doit être comprise entre 0,1
et 0,8 à 664 nm, avec une cuve de 1 cm de trajet optique. Dans le cas
d’une turbidité à 750 nm, soustraire la valeur trouvée des absorbances
à 664 et 630 nm.
• Calculer les concentrations d’après Jeffrey et Humphrey (1975), soit
pour les Diatomées et Chrysophycées :
[Chlorophille a](mg.l-1) = 11,47A664 - 0.40 A63o .
Détermination des constantes (Kx) de calibration du fluorimètre et de (Fq/Fa) max.
• Réaliser une gamme de dilutions à partir de l’étalon.
• Mesurer la fluorescence Fo ; il faut trois points de mesure pour chacune
des fentes du fluorimètre. On obtient ainsi pour chaque fente :
[Chlorophylle a] = Kx x Fluorescence .
• (Fq/Fa) max est obtenu par acidification puisque la solution mère est
supposée ne pas contenir de phéopigments.
• S’assurer par la méthode spectrophotométrique de Lorenzen (1967)
que le rapport des absorbances avant et après acidification à 665 nm
indique bien une absence de phéopigment.
La stabilité de réponse du fluorimètre turner 111 est bonne : deux étalonnages par an en principe suffisent ; toutefois, il faut refaire l'étalonnage
à chaque modification de l’appareillage : lampe, photomultiplicateur, filtres
optiques.
7.4.2. Etalonnage avec de la chlorophylle a du commerce (sigma)
Plusieurs laboratoires utilisent cette solution pour leur étalonnage.
• Mettre la chlorophylle a en solution dans l’acétone à 90 %.
• Déterminer la concentration en chlorophylle de cette solution par spectrophotométrie comme suit : mesurer l’absorbance à 664 nm (1 cm de
trajet optique) qui doit être comprise entre 0,1 et 0,8 et calculer la concentration à l’aide du coefficient d’absorption spécifique déterminé par
Jeffrey et Humphrey (1975) :
A
[Chlorophylle a] (mg.l-1) =
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