CHLOROPHYLLE - SPECTROPHOTOMÉTRIE
• Laisser revenir à température ambiante ; si nécessaire, ajuster exactement le volume, boucher et agiter.
• Centrifuger 1 min, retirer les tubes de la centrifugeuse et faire tomber
les fibres de verre, qui adhèrent à la paroi au-dessus de la surface du
solvant, par un léger mouvement d’agitation.
• Centrifuger à nouveau 5 à 10 min à 3000-4000 tr.min-1 ; les tubes doivent rester bouchés pour éviter l’évaporation (b).
7.3. MESURES D’ABSORBANCE
7.3.1. Longueurs d’onde des mesures
Selon la méthode utilisée, les mesures des absorbances doivent se faire
aux longueurs d’onde suivantes :
— Méthode de Lorenzen (acétone ou méthanol) : 665 et 750 nm,
— Méthode trichromatique :
* Unesco (1966)
: 630, 645, 663 et 750 nm,
* Jeffrey et Humphrey (1975) : 630, 647, 664 et 750 nm.
7.3.2. Détermination des blancs
Deux blancs entrent en jeu dans les mesures spectrophotométriques de
la chlorophylle : le blanc des cuves et le blanc de turbidité.
Le blanc des cuves bc doit être déterminé car il peut ne pas être négligeable
devant les faibles absorbances généralement mesurées sur les extraits naturels.
• Remplir les deux cuves du spectrophotomètre avec le solvant d’extraction
(acétone à 90 % ou méthanol).
• Mesurer les absorbances à ± 0,001 à toutes les longueurs d’onde prises
en compte dans la méthode utilisée (§ 7.3.1) ; on obtient les blancs bc750,
Le blanc de turbidité résulte de la présence de fines particules dans l’extrait
ainsi que, proFablëment, de colloïdes provenant d’une dissolution imparfaite
des membranes d’ester de cellulose (Creitz et Richards, 1955; Burnison,
1980). La mesure du blanc de turbidité s’effectue sur chaque échantillon à la
longueur d’onde de 750 nm, à laquelle les pigments n’absorbent pas ; on obtient
le blanc brut Ab150. Le blanc net de turbidité est obtenu en soustrayant le
blanc des cuves : Ab75O — bc750.
Ce blanc doit être inférieur à 0,005 unité d'absorbance par centimètre
de trajet optique.
Les filtres de fibre de verre bien centrifugés ne créent aucune turbidité.
Les membranes d'esters de cellulose donnent des absorbances mesurables
dans l’acétone à 90%. D'après Creitz et Richards (1955), ces filtres, dans
5 ml de solvant, donnent les absorbances :
— Filtre AA millipore 47 mm :
0,001 pour 5 cm de trajet optique.
— Filtre HA millipore 47 mm : ~ 0,005 pour 5 cm de trajet optique.
(b) La centrifugation peut être remplacée par une filtration de l'extrait, mais cette pratique exige
de grandes précautions (possibilité d'évaporation, de contaminations, de perte d extrait, d exposition à la lumière. ...).
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• Laisser revenir à température ambiante ; si nécessaire, ajuster exactement le volume, boucher et agiter.
• Centrifuger 1 min, retirer les tubes de la centrifugeuse et faire tomber
les fibres de verre, qui adhèrent à la paroi au-dessus de la surface du
solvant, par un léger mouvement d’agitation.
• Centrifuger à nouveau 5 à 10 min à 3000-4000 tr.min-1 ; les tubes doivent rester bouchés pour éviter l’évaporation (b).
7.3. MESURES D’ABSORBANCE
7.3.1. Longueurs d’onde des mesures
Selon la méthode utilisée, les mesures des absorbances doivent se faire
aux longueurs d’onde suivantes :
— Méthode de Lorenzen (acétone ou méthanol) : 665 et 750 nm,
— Méthode trichromatique :
* Unesco (1966)
: 630, 645, 663 et 750 nm,
* Jeffrey et Humphrey (1975) : 630, 647, 664 et 750 nm.
7.3.2. Détermination des blancs
Deux blancs entrent en jeu dans les mesures spectrophotométriques de
la chlorophylle : le blanc des cuves et le blanc de turbidité.
Le blanc des cuves bc doit être déterminé car il peut ne pas être négligeable
devant les faibles absorbances généralement mesurées sur les extraits naturels.
• Remplir les deux cuves du spectrophotomètre avec le solvant d’extraction
(acétone à 90 % ou méthanol).
• Mesurer les absorbances à ± 0,001 à toutes les longueurs d’onde prises
en compte dans la méthode utilisée (§ 7.3.1) ; on obtient les blancs bc750,
Le blanc de turbidité résulte de la présence de fines particules dans l’extrait
ainsi que, proFablëment, de colloïdes provenant d’une dissolution imparfaite
des membranes d’ester de cellulose (Creitz et Richards, 1955; Burnison,
1980). La mesure du blanc de turbidité s’effectue sur chaque échantillon à la
longueur d’onde de 750 nm, à laquelle les pigments n’absorbent pas ; on obtient
le blanc brut Ab150. Le blanc net de turbidité est obtenu en soustrayant le
blanc des cuves : Ab75O — bc750.
Ce blanc doit être inférieur à 0,005 unité d'absorbance par centimètre
de trajet optique.
Les filtres de fibre de verre bien centrifugés ne créent aucune turbidité.
Les membranes d'esters de cellulose donnent des absorbances mesurables
dans l’acétone à 90%. D'après Creitz et Richards (1955), ces filtres, dans
5 ml de solvant, donnent les absorbances :
— Filtre AA millipore 47 mm :
0,001 pour 5 cm de trajet optique.
— Filtre HA millipore 47 mm : ~ 0,005 pour 5 cm de trajet optique.
(b) La centrifugation peut être remplacée par une filtration de l'extrait, mais cette pratique exige
de grandes précautions (possibilité d'évaporation, de contaminations, de perte d extrait, d exposition à la lumière. ...).
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