CHLOROPHYLLE - SPECTROPHOTOMÉTRIE
d'absorption, essentiellement pour la chlorophylle c. Les résultats pour les
chlorophylles a et b sont très peu différents de ceux fournis par les autres
équations, mais pour la chlorophylle c ils sont plus faibles d’environ 50 %.
Mr La méthode monochromatique de Lorenzen (1967) ne permet, quant à
elle, de déterminer que les pigments chlorophylliens de type a, mais elle a
l’avantage de donner la concentration en phéopigments. Moss (1967a et b)
avait également proposé une méthode du même type mais moins simple et
moins pratique. L’absorbance de l’extrait pigmentaire est mesurée à 665 nm
avant puis après acidification, c’est-à-dire en transformant toute la chlorophylle en phéopigments. Le coefficient d’absorption spécifique des phéopigments étant plus faible que celui de la chlorophylle, la baisse d’absorbance
résultant de l’acidification permet de connaître le rapport des deux formes.
L’acidification pratiquée dans la méthode monochromatique doit être
effectuée avec rigueur. Moed et Hallegraeff (1978) ont en effet montré
que la quantité d’acide doit être suffisante pour transformer la chlorophylle
en phéopigments. mais qu’un trop grand excès peut parfois être source d’erreurs importantes :
— Déplacement du maximum d’absorption des phéopigments,
— Transformation des époxycaroténoïdes en composés absorbant dans
le rouge, zone d’absorption de la chlorophylle,
— Réactions secondaires lentes engendrant une dérive continue de la
mesure.
Selon ces auteurs, le pH optimal après acidification est de 2,6-2,8, mais
dans l’acétone à 90 % la tolérance de pH est plus élevée, car ces réactions
secondaires sont plus lentes. On s’attachera donc à respecter rigoureusement
le présent mode opératoire, qui s’appuie sur la procédure proposée par
Holm-Hansen et Riemann (1978) : l’extrait est acidifié à 0,003 mol.T1 en
HCl, contrairement à tous les précédents auteurs qui proposaient une acidification excessive.
1.4. VALIDITÉ DES MÉTHODES
Si les équations trichromatiques sont intéressantes pour connaître les
concentrations des différents types de chlorophylles, en revanche, comme le
reconnaissent les auteurs des diverses méthodes, la présence de phéopigments
peut entraîner de sérieuses erreurs. Les phéopigments a. par exemple, sont
assimilés à de la chlorophylle pour environ 60 % de leur concentration.
La méthode de Lorenzen permet de déterminer uniquement les concentrations en chlorophylle a et phéopigments a, qui sont les formes les plus
importantes et les plus couramment recherchées. Bien qu’il n’y ait pas de
distinction entre phéophytine et phéophorbide, il est néanmoins correct, du
point de vue spectrophotométrique, de les grouper sous le terme de phéopigments en raison de l’identité de leurs coefficients d’absorptio/i spécifique
(Shuman et Lorenzen, 1975). La présence de quantités importantes de
chlorophylle b peut introduire une légère surestimation de la chlorophylle a
et des phéopigments a (Holm-Hansen et Riemann, 1978) : toutefois les eaux
océaniques superficielles étant très pauvres en chlorophylle b (Parsons. 1966).
c’est en eaux estuariennes très dessalées ou au niveau des maximums océa181
d'absorption, essentiellement pour la chlorophylle c. Les résultats pour les
chlorophylles a et b sont très peu différents de ceux fournis par les autres
équations, mais pour la chlorophylle c ils sont plus faibles d’environ 50 %.
Mr La méthode monochromatique de Lorenzen (1967) ne permet, quant à
elle, de déterminer que les pigments chlorophylliens de type a, mais elle a
l’avantage de donner la concentration en phéopigments. Moss (1967a et b)
avait également proposé une méthode du même type mais moins simple et
moins pratique. L’absorbance de l’extrait pigmentaire est mesurée à 665 nm
avant puis après acidification, c’est-à-dire en transformant toute la chlorophylle en phéopigments. Le coefficient d’absorption spécifique des phéopigments étant plus faible que celui de la chlorophylle, la baisse d’absorbance
résultant de l’acidification permet de connaître le rapport des deux formes.
L’acidification pratiquée dans la méthode monochromatique doit être
effectuée avec rigueur. Moed et Hallegraeff (1978) ont en effet montré
que la quantité d’acide doit être suffisante pour transformer la chlorophylle
en phéopigments. mais qu’un trop grand excès peut parfois être source d’erreurs importantes :
— Déplacement du maximum d’absorption des phéopigments,
— Transformation des époxycaroténoïdes en composés absorbant dans
le rouge, zone d’absorption de la chlorophylle,
— Réactions secondaires lentes engendrant une dérive continue de la
mesure.
Selon ces auteurs, le pH optimal après acidification est de 2,6-2,8, mais
dans l’acétone à 90 % la tolérance de pH est plus élevée, car ces réactions
secondaires sont plus lentes. On s’attachera donc à respecter rigoureusement
le présent mode opératoire, qui s’appuie sur la procédure proposée par
Holm-Hansen et Riemann (1978) : l’extrait est acidifié à 0,003 mol.T1 en
HCl, contrairement à tous les précédents auteurs qui proposaient une acidification excessive.
1.4. VALIDITÉ DES MÉTHODES
Si les équations trichromatiques sont intéressantes pour connaître les
concentrations des différents types de chlorophylles, en revanche, comme le
reconnaissent les auteurs des diverses méthodes, la présence de phéopigments
peut entraîner de sérieuses erreurs. Les phéopigments a. par exemple, sont
assimilés à de la chlorophylle pour environ 60 % de leur concentration.
La méthode de Lorenzen permet de déterminer uniquement les concentrations en chlorophylle a et phéopigments a, qui sont les formes les plus
importantes et les plus couramment recherchées. Bien qu’il n’y ait pas de
distinction entre phéophytine et phéophorbide, il est néanmoins correct, du
point de vue spectrophotométrique, de les grouper sous le terme de phéopigments en raison de l’identité de leurs coefficients d’absorptio/i spécifique
(Shuman et Lorenzen, 1975). La présence de quantités importantes de
chlorophylle b peut introduire une légère surestimation de la chlorophylle a
et des phéopigments a (Holm-Hansen et Riemann, 1978) : toutefois les eaux
océaniques superficielles étant très pauvres en chlorophylle b (Parsons. 1966).
c’est en eaux estuariennes très dessalées ou au niveau des maximums océa181