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Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire
4.2.2. Isolement
À partir du bouillon d’enrichissement sélectif primaire, ensemencer par isolement (en stries) :
- une boîte de gélose Ottaviani Agosti ;
-et au choix, une boîte d’un autre milieu sélectif pour Listeria tel que la
gélose Oxford ou Palcam.
Incuber la première boîte à 37 ± 1 °C pendant 24 ± 3 heures et 24 ± 3 heures
supplémentaires si nécessaire. Incuber la deuxième boîte de 35 à 37 °C pendant
24 à 48 heures ou selon les recommandations du fabricant.
Observer sur le premier milieu de culture les colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes (cf. supra, paragraphe 4.1.2.3.) et sur le second les colonies
typiques de Listeria spp. (cf supra, paragraphe 4.1.3.4.). Procéder à leur confirmation (cf infra, paragraphe 4.4.).
4.2.3. Enrichissement secondaire
Après incubation du bouillon d’enrichissement primaire, transférer aseptiquement 0,1 mL dans 10 mL de bouillon de Fraser pour enrichissement sélectif
secondaire.
Incuber le tube à l’étuve à 37 °C pendant 48 ± 2 heures.
Isoler les Listeria en ensemençant à nouveau deux boîtes de milieu sélectif
comme ci-dessus. Observer les colonies caractéristiques et procéder à leur
confirmation (cf. infra, paragraphe 4.4.).
4.3.
Dénombrement conventionnel
4.3.1. Enrichissement
Préparer la suspension mère de l'aliment en eau peptonée tamponnée (cf. première partie, chapitre 4 « Méthodes de travail en microbiologie », paragraphe
3.1.1.2.) ou en bouillon Fraser-Demi sans chlorure de lithium et sans supplément
sélectif (il faut alors utiliser un bouillon Fraser-Demi disponible en milieu déshydraté).
Laisser la suspension mère à 20 ± 2 °C pendant 60 ± 5 minutes afin de revivifier les micro-organismes stressés. Des dilutions décimales peuvent être préparées.
4.3.2. Dénombrement
Déposer, à I aide d une pipette stérile, 0,1 mL de la suspension préparée sur
deux boîtes de gélose Ottaviani Agosti et étaler en surface avec un étaleur stérile
Répéter 1 opération avec les dilutions décimales si nécessaire.
Laisser la boîte de Pétri à température ambiante pendant 15 minutes pour per
mettre I absorption de l’inoculum.
Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire
4.2.2. Isolement
À partir du bouillon d’enrichissement sélectif primaire, ensemencer par isolement (en stries) :
- une boîte de gélose Ottaviani Agosti ;
-et au choix, une boîte d’un autre milieu sélectif pour Listeria tel que la
gélose Oxford ou Palcam.
Incuber la première boîte à 37 ± 1 °C pendant 24 ± 3 heures et 24 ± 3 heures
supplémentaires si nécessaire. Incuber la deuxième boîte de 35 à 37 °C pendant
24 à 48 heures ou selon les recommandations du fabricant.
Observer sur le premier milieu de culture les colonies caractéristiques de Listeria monocytogenes (cf. supra, paragraphe 4.1.2.3.) et sur le second les colonies
typiques de Listeria spp. (cf supra, paragraphe 4.1.3.4.). Procéder à leur confirmation (cf infra, paragraphe 4.4.).
4.2.3. Enrichissement secondaire
Après incubation du bouillon d’enrichissement primaire, transférer aseptiquement 0,1 mL dans 10 mL de bouillon de Fraser pour enrichissement sélectif
secondaire.
Incuber le tube à l’étuve à 37 °C pendant 48 ± 2 heures.
Isoler les Listeria en ensemençant à nouveau deux boîtes de milieu sélectif
comme ci-dessus. Observer les colonies caractéristiques et procéder à leur
confirmation (cf. infra, paragraphe 4.4.).
4.3.
Dénombrement conventionnel
4.3.1. Enrichissement
Préparer la suspension mère de l'aliment en eau peptonée tamponnée (cf. première partie, chapitre 4 « Méthodes de travail en microbiologie », paragraphe
3.1.1.2.) ou en bouillon Fraser-Demi sans chlorure de lithium et sans supplément
sélectif (il faut alors utiliser un bouillon Fraser-Demi disponible en milieu déshydraté).
Laisser la suspension mère à 20 ± 2 °C pendant 60 ± 5 minutes afin de revivifier les micro-organismes stressés. Des dilutions décimales peuvent être préparées.
4.3.2. Dénombrement
Déposer, à I aide d une pipette stérile, 0,1 mL de la suspension préparée sur
deux boîtes de gélose Ottaviani Agosti et étaler en surface avec un étaleur stérile
Répéter 1 opération avec les dilutions décimales si nécessaire.
Laisser la boîte de Pétri à température ambiante pendant 15 minutes pour per
mettre I absorption de l’inoculum.