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Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire
► Mode d'action
Les sels biliaires inhibent la plupart des bactéries à Gram+.
Le mélange chromogène contient deux substrats :
- le premier, pour la mise en évidence de la P-D-glucuronidase spécifique des
Escherichia coli (sauf le sérotype E. coli O 157 : H7), peut être du 5-bromo4chloro-3indolyl p-D-glucuronate, recommandé par la norme NF ISO 16649-2
(substrat non précisé dans la fiche technique du milieu) ;
- le deuxième pour la mise en évidence de la p-galactosidase chez les coliformes.
7.1.1.2. Ensemencement et incubation du milieu
A partir de la suspension mère préparée à partir d’un aliment, trois protocoles
d’ensemencement peuvent être appliqués ; ils sont présentés d’après la fiche
technique du milieu :
• Premier protocole pour le dénombrement d’E. coli P-D-glucuronidase positive (validé Afnor) en accord avec la norme NF ISO 16649-2 :
- déposer 1 mL de la suspension mère ou des dilutions décimales dans des
boîtes de Pétri vides stériles (une boîte par dilution) ;
- verser 15 mL de milieu Coli ID maintenu en surfusion à 47 °C environ par
boîte de Pétri, homogénéiser et laisser solidifier ;
- incuber les boîtes à 44 ± 1 °C pendant 24 ± 2 heures ;
-dénombrer les colonies d'Escherichia coli P-D-glucuronidase+ (cf. infra.
paragraphe 7.1.1.3.) dans les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies caractéristiques et appliquer la formule de calcul de la norme précitée. Dans le cas où la
plus faible dilution testée contient un nombre inférieur à 15 colonies caractéristiques. utiliser 1 estimation des petits nombres de la norme.
• Deuxième protocole pour le dénombrement simultané d'Escherichia coli
P-D-glucuronidase+ et des autres coliformes par ensemencement en profondeur
(non soumis à la validation Afnor) :
— suivant le même mode opératoire que ci-dessus, ensemencer des boîtes de
Pétri, puis après solidification du milieu, couler une deuxième couche de milieu
C oli II) maintenu en surfusion (5 mL environ) et laisser solidifier. Ce procédé de
iras ail de la deuxième couche évite l 'envahissement en surface par certains
micro-organismes après incubation à 37 °C ;
- incuber les boîtes à 37 ± 1 °C pendant 24 à 48 heures ;
dénombrer les colonies caractéristiques d'Escherichia coli p-D-glucuronidase+ et celles des autres coliformes (cf. infra, paragraphe 7.1.1.3.), sachant que
e nombre de coliformes totaux est égal à la somme des deux types de colonies.
Le mode de calcul est le même que dans le premier protocole.
• I roisième protocole pour le dénombrement d'Escherichia coli P-D-giucuromdase+ par ensemencement en surface (non validé par Afnor) :
- préparer des boîtes de Pétri (90 ou 55 mm de diamètre) de gélose Coli ID :
étaler à la surface du milieu 0,1 mL de la suspension mère (ou d'une dilution)
< u i eposer une membrane filtrante provenant d'une filtration de l’échantillon :
Microbiologie pratique pour le laboratoire d’analyses ou de contrôle sanitaire
► Mode d'action
Les sels biliaires inhibent la plupart des bactéries à Gram+.
Le mélange chromogène contient deux substrats :
- le premier, pour la mise en évidence de la P-D-glucuronidase spécifique des
Escherichia coli (sauf le sérotype E. coli O 157 : H7), peut être du 5-bromo4chloro-3indolyl p-D-glucuronate, recommandé par la norme NF ISO 16649-2
(substrat non précisé dans la fiche technique du milieu) ;
- le deuxième pour la mise en évidence de la p-galactosidase chez les coliformes.
7.1.1.2. Ensemencement et incubation du milieu
A partir de la suspension mère préparée à partir d’un aliment, trois protocoles
d’ensemencement peuvent être appliqués ; ils sont présentés d’après la fiche
technique du milieu :
• Premier protocole pour le dénombrement d’E. coli P-D-glucuronidase positive (validé Afnor) en accord avec la norme NF ISO 16649-2 :
- déposer 1 mL de la suspension mère ou des dilutions décimales dans des
boîtes de Pétri vides stériles (une boîte par dilution) ;
- verser 15 mL de milieu Coli ID maintenu en surfusion à 47 °C environ par
boîte de Pétri, homogénéiser et laisser solidifier ;
- incuber les boîtes à 44 ± 1 °C pendant 24 ± 2 heures ;
-dénombrer les colonies d'Escherichia coli P-D-glucuronidase+ (cf. infra.
paragraphe 7.1.1.3.) dans les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies caractéristiques et appliquer la formule de calcul de la norme précitée. Dans le cas où la
plus faible dilution testée contient un nombre inférieur à 15 colonies caractéristiques. utiliser 1 estimation des petits nombres de la norme.
• Deuxième protocole pour le dénombrement simultané d'Escherichia coli
P-D-glucuronidase+ et des autres coliformes par ensemencement en profondeur
(non soumis à la validation Afnor) :
— suivant le même mode opératoire que ci-dessus, ensemencer des boîtes de
Pétri, puis après solidification du milieu, couler une deuxième couche de milieu
C oli II) maintenu en surfusion (5 mL environ) et laisser solidifier. Ce procédé de
iras ail de la deuxième couche évite l 'envahissement en surface par certains
micro-organismes après incubation à 37 °C ;
- incuber les boîtes à 37 ± 1 °C pendant 24 à 48 heures ;
dénombrer les colonies caractéristiques d'Escherichia coli p-D-glucuronidase+ et celles des autres coliformes (cf. infra, paragraphe 7.1.1.3.), sachant que
e nombre de coliformes totaux est égal à la somme des deux types de colonies.
Le mode de calcul est le même que dans le premier protocole.
• I roisième protocole pour le dénombrement d'Escherichia coli P-D-giucuromdase+ par ensemencement en surface (non validé par Afnor) :
- préparer des boîtes de Pétri (90 ou 55 mm de diamètre) de gélose Coli ID :
étaler à la surface du milieu 0,1 mL de la suspension mère (ou d'une dilution)
< u i eposer une membrane filtrante provenant d'une filtration de l’échantillon :