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Chapitre 6. Technique de Séquençage
6.1. Séquençage par la méthode de Sanger
C’est une méthode qui permet la connaissance de la composition en base d’une séquence
d’ADN. C’est une méthode enzymatique basée sur la synthèse du brin complémentaire qui est
interrompue par l’incorporation d’un terminateur de chaîne (ddNTP di-desoxyribonucléotide)
qui est capable de s’intégrer dans la chaîne d’ADN néosynthétisée, mais empêche la fixation
d’un nucléotide suivant.
Le séquençage peut se faire par un clonage dans un vecteur ou par PCR. Dans les deux cas, il
est important d’avoir une amorce avec une extrémité 5’P marquée. On mélange l'ADN
matrice et les molécules d'oligonucléotides avec le tampon et les désoxynucléotides
triphosphate (dNTP). On dénature l'ensemble et on ajoute la polymérase. Cette préparation est
partagée en 4 fractions. A chacune des fractions, on ajoute une faible quantité d'un
didesoxynucléotide triphosphate (ddNTP).
Dans chaque tube, chaque fois qu’un ddNTP est incorporé à une position, l’élongation est
arrêtée, ce qui génère un ensemble de molécules de tailles différentes qui se terminent par le
même
ddNTP.
Figure 6.1. La structure du DNTP et du DDNTP
Les différents fragments sont séparés en fonction de leur taille. La lecture de la séquence se
fait du 5’ à 3’ du bas vers le haut. La séquence de l’ADN à séquencer est la séquence
complémentaire de celle lue en électrophorèse.