32
Les différentes techniques d’hybridation sont:
• Hybridation en milieu liquide
• Hybridation en milieu solide: Southern blot: ADN/ADN
•
Norhern blot ADN/ARN
•
Dot blot et Slot blot
• Hybridation in situ
4.3. Marquage des acides nucléiques
4.3.1. Marquage chaud (radioactivité) (figure 4.3)
Marquage par multi-amorçage au hasard (Random Printing)
Cette méthode est basée sur l’utilisation d’amorces hexa-nucléotidiques aléatoires. Certaines
vont s’hybrider avec l’ADN à marquer. Ces oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au
fragment de Klenow qui va synthétiser le fragment d’ADN entre les amorces en utilisant des
dNTPs marqués au
32 P.
Cette méthode permet le marquage d’un ADN double brin pour obtenir à la fin deux copies de
sondes marquées.
Marquage par translation de coupure (Nick Translation)
Cette technique est basée sur l’utilisation de deux enzymes :
*ADNase: pour générer des coupures simple brin au hasard dans le fragment d'intérêt
*ADN polymerase I pour dégrader l'ADN dans le sens 5'-3' au niveau de ces coupures et
repolymériser en utilisant en moins un nucléotide chaud.
Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont marqués en position alpha au
32 P.
Marquage terminal
L’ADN peut être marqué à son extrémité 5’ à l’aide d’une kinase, par exemple, la T4
polynucléotide kinase.
En présence d’ATP radioactif avec du
32
P en position γ, il est possible d’échanger le
groupement 5’-phosphate présent sur le fragment d’ADN avec le phosphate radio-actif en
position γ sur l’ATP. Cette méthode est générale. Elle est plus efficace si les extrémités 5’sont préalablement déphosphorylées, par exemple par l’action d’une phosphatase alcaline.
Les différentes techniques d’hybridation sont:
• Hybridation en milieu liquide
• Hybridation en milieu solide: Southern blot: ADN/ADN
•
Norhern blot ADN/ARN
•
Dot blot et Slot blot
• Hybridation in situ
4.3. Marquage des acides nucléiques
4.3.1. Marquage chaud (radioactivité) (figure 4.3)
Marquage par multi-amorçage au hasard (Random Printing)
Cette méthode est basée sur l’utilisation d’amorces hexa-nucléotidiques aléatoires. Certaines
vont s’hybrider avec l’ADN à marquer. Ces oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au
fragment de Klenow qui va synthétiser le fragment d’ADN entre les amorces en utilisant des
dNTPs marqués au
32 P.
Cette méthode permet le marquage d’un ADN double brin pour obtenir à la fin deux copies de
sondes marquées.
Marquage par translation de coupure (Nick Translation)
Cette technique est basée sur l’utilisation de deux enzymes :
*ADNase: pour générer des coupures simple brin au hasard dans le fragment d'intérêt
*ADN polymerase I pour dégrader l'ADN dans le sens 5'-3' au niveau de ces coupures et
repolymériser en utilisant en moins un nucléotide chaud.
Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont marqués en position alpha au
32 P.
Marquage terminal
L’ADN peut être marqué à son extrémité 5’ à l’aide d’une kinase, par exemple, la T4
polynucléotide kinase.
En présence d’ATP radioactif avec du
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P en position γ, il est possible d’échanger le
groupement 5’-phosphate présent sur le fragment d’ADN avec le phosphate radio-actif en
position γ sur l’ATP. Cette méthode est générale. Elle est plus efficace si les extrémités 5’sont préalablement déphosphorylées, par exemple par l’action d’une phosphatase alcaline.