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4.1. La température de fusion de l’ADN
C’est une température, appelée également température de demi dénaturation (Tm) qui
correspond à l’ouverture ou au déroulement de 50% de la chaîne de l’ADN chauffé. C'est
l'effet hyperchromique qui correspond à la rupture des liaisons hydrogènes (liaisons faibles)
et la séparation des deux chaînes entraîne une augmentation dans l'absorption d'U.V de 40% à
260 nm (figure 4.1.). Plusieurs facteurs peuvent influencer la valeur de la Tm :
4.1.1. La composition en bases
La complémentarité des deux brins de l’ADN est maintenue grâce à l’appariement entre G et
C d’une part et A et T d’autre part. Mais le nombre de liaison hydrogène n’est pas le même
pour chaque couple de base. Il est évident donc que le nombre de bases sera un facteur non
négligeable dans le calcul de la Tm. De manière générale, on note que la relation entre la
composition en G+C et la T m est de nature linéaire pour des ADN de longueurs identiques
ou suffisamment longs (> 200pb) : Tm = 69,3 + 0,41 (%G+C). Mais en pratique, pour les
oligonucléotides (de 11 à 20 bases), on utilise plutôt la formule : Tm = 2(A+T) + 4(G+C).
4.1.2. Les mésappariements
De manière générale, l’abaissement de la Tm est de 1°C pour une valeur de 1% de
mésappariement (mismatch).
4.1.3. La nature du milieu de l’ADN
Les sels sous forme de cations monovalents, lorsqu’ils sont ajoutés aux fortes concentrations
(>1M) n’influencent pas les valeurs de Tm. Par contre, aux faibles concentrations, la Tm
diminue. Cette diminution est de 15°C pour une unité logarithmique de concentration ionique.
Les cations divalents ont un effet encore plus important.
D’autres substances telles que le formamide peuvent abaisser la Tm lors des hybridations.
Dans ce cas, la Tm est estimée selon la formule suivante (pour 100 pb) :
∆Tm = -0,6 x (% formamide).
4.1.4. La longueur des fragments des ADN
La Tm devient plus grande si la longueur de l’ADN l’est aussi : un ADN long contient plus
de liaisons à dissocier qu’un ADN plus court. La variation de température de fusion est
4.1. La température de fusion de l’ADN
C’est une température, appelée également température de demi dénaturation (Tm) qui
correspond à l’ouverture ou au déroulement de 50% de la chaîne de l’ADN chauffé. C'est
l'effet hyperchromique qui correspond à la rupture des liaisons hydrogènes (liaisons faibles)
et la séparation des deux chaînes entraîne une augmentation dans l'absorption d'U.V de 40% à
260 nm (figure 4.1.). Plusieurs facteurs peuvent influencer la valeur de la Tm :
4.1.1. La composition en bases
La complémentarité des deux brins de l’ADN est maintenue grâce à l’appariement entre G et
C d’une part et A et T d’autre part. Mais le nombre de liaison hydrogène n’est pas le même
pour chaque couple de base. Il est évident donc que le nombre de bases sera un facteur non
négligeable dans le calcul de la Tm. De manière générale, on note que la relation entre la
composition en G+C et la T m est de nature linéaire pour des ADN de longueurs identiques
ou suffisamment longs (> 200pb) : Tm = 69,3 + 0,41 (%G+C). Mais en pratique, pour les
oligonucléotides (de 11 à 20 bases), on utilise plutôt la formule : Tm = 2(A+T) + 4(G+C).
4.1.2. Les mésappariements
De manière générale, l’abaissement de la Tm est de 1°C pour une valeur de 1% de
mésappariement (mismatch).
4.1.3. La nature du milieu de l’ADN
Les sels sous forme de cations monovalents, lorsqu’ils sont ajoutés aux fortes concentrations
(>1M) n’influencent pas les valeurs de Tm. Par contre, aux faibles concentrations, la Tm
diminue. Cette diminution est de 15°C pour une unité logarithmique de concentration ionique.
Les cations divalents ont un effet encore plus important.
D’autres substances telles que le formamide peuvent abaisser la Tm lors des hybridations.
Dans ce cas, la Tm est estimée selon la formule suivante (pour 100 pb) :
∆Tm = -0,6 x (% formamide).
4.1.4. La longueur des fragments des ADN
La Tm devient plus grande si la longueur de l’ADN l’est aussi : un ADN long contient plus
de liaisons à dissocier qu’un ADN plus court. La variation de température de fusion est