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Protocole d’extraction d’ARN au thiocyanate de guanidinium
• Pour extraire l’ARN d’un tissu ou d’une suspension de cellules, il faut impérativement
inhiber toute trace de RNase.
• L’homogénéisation dans le tube de Potter se fait dans un tampon Tris-EDTA en
présence de thiocyanate de guanidinium 4 M et de SDS. Les débris cellulaires sont
sédimentés en 10 min à 10 °C.
• Le surnageant contenant les acides nucléiques est déposé sur un gradient de densité
comprenant au fond du tube une solution très dense de CsCl 5,7 M surmontée d’une
couche intermédiaire de CsCl 2,4 M. Ce gradient est ultracentrifugé durant 24 heures à
30000 tours/min à la température ambiante.
• On peut alors recueillir un culot d’ARN de masses moléculaires élevées qui seront
soumis à l’extraction par le phénol et le chloroforme.
• L'ARN peut être conservé plus d'un an soit sous forme précipitée dans l'éthanol, soit
sous forme congelée à -80°C.
3.2.2. Purification des ARNm à partir des ARN totaux
La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue polyadénylée (polyA) à son extrémité
3', utilisée pour purifier les ARNm par chromatographie d’affinité :
- Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites de fixation sont des
oligonucléotides polydT ou polyU.
- Eluer les ARNm et les récupérer par précipitation par l'alcool éthylique absolu froid. On
obtient ~50%d'ARN non polyA. Pour enrichir en ARN polyA, repasser sur la colonne une
autre fois.
3.3. Séparation et visualisation de l’ADN
3.3.1. L’électrophorèse
C’est une méthode de séparation basée sur la charge et le poids moléculaire des acides
nucléiques ou des protéines. Sous l’effet du champ électrique, l’ADN chargé négativement
migre à travers la matrice du gel à partir de la cathode (-) vers l’anode (+). Les molécules de
petite taille migrent plus rapidement. Le log PM est inversement proportionnel à la distance
de migration.
La mobilité de la molécule (μ) dans un gel soumis à un champ électrique est:
Log μ= Log μo - Kr. C
Protocole d’extraction d’ARN au thiocyanate de guanidinium
• Pour extraire l’ARN d’un tissu ou d’une suspension de cellules, il faut impérativement
inhiber toute trace de RNase.
• L’homogénéisation dans le tube de Potter se fait dans un tampon Tris-EDTA en
présence de thiocyanate de guanidinium 4 M et de SDS. Les débris cellulaires sont
sédimentés en 10 min à 10 °C.
• Le surnageant contenant les acides nucléiques est déposé sur un gradient de densité
comprenant au fond du tube une solution très dense de CsCl 5,7 M surmontée d’une
couche intermédiaire de CsCl 2,4 M. Ce gradient est ultracentrifugé durant 24 heures à
30000 tours/min à la température ambiante.
• On peut alors recueillir un culot d’ARN de masses moléculaires élevées qui seront
soumis à l’extraction par le phénol et le chloroforme.
• L'ARN peut être conservé plus d'un an soit sous forme précipitée dans l'éthanol, soit
sous forme congelée à -80°C.
3.2.2. Purification des ARNm à partir des ARN totaux
La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue polyadénylée (polyA) à son extrémité
3', utilisée pour purifier les ARNm par chromatographie d’affinité :
- Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites de fixation sont des
oligonucléotides polydT ou polyU.
- Eluer les ARNm et les récupérer par précipitation par l'alcool éthylique absolu froid. On
obtient ~50%d'ARN non polyA. Pour enrichir en ARN polyA, repasser sur la colonne une
autre fois.
3.3. Séparation et visualisation de l’ADN
3.3.1. L’électrophorèse
C’est une méthode de séparation basée sur la charge et le poids moléculaire des acides
nucléiques ou des protéines. Sous l’effet du champ électrique, l’ADN chargé négativement
migre à travers la matrice du gel à partir de la cathode (-) vers l’anode (+). Les molécules de
petite taille migrent plus rapidement. Le log PM est inversement proportionnel à la distance
de migration.
La mobilité de la molécule (μ) dans un gel soumis à un champ électrique est:
Log μ= Log μo - Kr. C