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• L’ homogénat obtenu sera dissous avec une solution de lyse (tampon sans pression
osmotique, faisant éclater les membranes fermées) en présence d’EDTA et de
laurylsulfate de Sodium (SDS) qui inhibent les nucléases.
• Incuber toute la nuit en présence de la protéinase k qui a pour rôle de digérer les
protéines associées à l'ADN.
• Les solutions d’acides nucléiques et de protéines issues des préparations précédentes
sont purifiées par addition de phénol saturé de tampon Tris-EDTA. Après une
centrifugation de 10 min sous 10000 g à la température de 4°C, on distingue une phase
aqueuse surnageante contenant les acides nucléiques en solution, une phase organique
au fond du tube qui représente le phénol et lipides et à l’interface un « gâteau » de
protéines précipitées.
• La phase aqueuse récupérée est laver par un mélange de chloroforme (CHCl3) et
d’alcool isoamylique dans un rapport 24:1 (volume: volume). On recueille à nouveau
une phase aqueuse contenant l’ADN en solution et une phase organique contenant des
restes de phénol, de protéines et de lipides.
La purification d’une solution d’ADN se fait le plus souvent par précipitations répétées dans
l’alcool: isopropanol ou éthanol en présence de force ionique NaCl 3M. Un précipité
blanchâtre, translucide et filamenteux « la méduse » apparaît. Il est constitué de longs
filaments d’ADN précipité. Ce dernier est récupéré par centrifugation à 10000 g pendant un
quart d’heure environ. Un deuxième lavage dans l’éthanol à 75 % est effectué. Le culot de
cette dernière centrifugation est égoutté, puis séché sous vide.
L’ADN peut être conservé à sec ou dissout immédiatement soit dans de l’eau pure stérile, soit
dans un tampon Tris-EDTA.
3.2. Extraction de l’ARN
3.2.1. Extraction des ARN totaux
Pour extraire l’ARN d’un tissu ou d’une suspension de cellules, il faut impérativement inhiber
toute trace d’ RNase.
La méthode la plus sûre est la méthode de Chirgwin (extraction d'ARN à partir de pancréas,
tissu très riche en RNAses).
• L’ homogénat obtenu sera dissous avec une solution de lyse (tampon sans pression
osmotique, faisant éclater les membranes fermées) en présence d’EDTA et de
laurylsulfate de Sodium (SDS) qui inhibent les nucléases.
• Incuber toute la nuit en présence de la protéinase k qui a pour rôle de digérer les
protéines associées à l'ADN.
• Les solutions d’acides nucléiques et de protéines issues des préparations précédentes
sont purifiées par addition de phénol saturé de tampon Tris-EDTA. Après une
centrifugation de 10 min sous 10000 g à la température de 4°C, on distingue une phase
aqueuse surnageante contenant les acides nucléiques en solution, une phase organique
au fond du tube qui représente le phénol et lipides et à l’interface un « gâteau » de
protéines précipitées.
• La phase aqueuse récupérée est laver par un mélange de chloroforme (CHCl3) et
d’alcool isoamylique dans un rapport 24:1 (volume: volume). On recueille à nouveau
une phase aqueuse contenant l’ADN en solution et une phase organique contenant des
restes de phénol, de protéines et de lipides.
La purification d’une solution d’ADN se fait le plus souvent par précipitations répétées dans
l’alcool: isopropanol ou éthanol en présence de force ionique NaCl 3M. Un précipité
blanchâtre, translucide et filamenteux « la méduse » apparaît. Il est constitué de longs
filaments d’ADN précipité. Ce dernier est récupéré par centrifugation à 10000 g pendant un
quart d’heure environ. Un deuxième lavage dans l’éthanol à 75 % est effectué. Le culot de
cette dernière centrifugation est égoutté, puis séché sous vide.
L’ADN peut être conservé à sec ou dissout immédiatement soit dans de l’eau pure stérile, soit
dans un tampon Tris-EDTA.
3.2. Extraction de l’ARN
3.2.1. Extraction des ARN totaux
Pour extraire l’ARN d’un tissu ou d’une suspension de cellules, il faut impérativement inhiber
toute trace d’ RNase.
La méthode la plus sûre est la méthode de Chirgwin (extraction d'ARN à partir de pancréas,
tissu très riche en RNAses).