- les Erlens sont fermés au moyen de bouchons en caoutchouc. Chaque bouchon supporte, sur sa face inférieure, une coupelle dans laquelle est placé un filtre plissé en papier
Whatmann. Les fioles sont groupées en 6 séries de 3 ; chaque série correspondant à une
durée d’incubation : 0,10,30,60,90 et 120 minutes. L’injection de la solution de
14 C-A.A.
marque le début de l’expérimentation (fig. 1). Après rinçage de l’aiguille par 0,5 ml d’eau
distillée, 0,2 ml de phényléthylamine (piège à CO2) sont injectés dans la coupelle portefiltre. A l’issue de la période d’incubation, les prélèvements pour les numérations bactériennes sont effectués. Puis l’addition de 5 ml de formol neutralisé à 10% arrête le
développement des microorganismes.
- l’acidification par HCl 2N provoque le dégagement du CO2 dissous dans la phase
aqueuse. Ceci permet une mesure plus juste de la partie du traceur ayant été “respirée”.
Les filtres sont alors prélevés et dosés (voir ci-dessous).
- le lavage du sédiment par HCl 2N (120 ml), suivi d’une centrifugation (2500 rpm
pendant 10 mn), est destiné à détacher les A. A. faiblement fixés au sédiment.
- le sédiment après ce lavage subit une hydrolyse acide par HCl 6N (à 106°C pendant
24 h). Cette opération a pour but d’hydrolyser les liaisons peptidiques et de permettre le
dosage des A. A. combinés.
Des témoins sont effectués à différents niveaux de ce protocole. Au temps 0 le formol est
injecté avant le traceur, ceci donne un “blanc”. Les phénomènes d’adsorption sont
contrôlés par un témoin sans sédiment, pour connaître l’adsorption parasite due à la fiole.
Ce dosage indique une adsorption négligeable de 1%. La fixation du
14 C-CO 2 est
également testée, grâce à une solution de
14 C-HCO 3
- dans les conditions de l’expérience
99,6% de la radioactivité est retrouvée sur le filtre imprégné de phényléthylamine. Un
autre témoin consiste à mesurer directement la radioactivité d’1 ml de la solution d’A.A.
marqués, utilisée lors des expériences. On obtient 1 900 000 d.p.m.
Afin d’opérer une distinction entre les phénomènes physico-chimiques d’adsorption et
l’activité biologique, nous avons bloqué le métabolisme bactérien en réalisant une opération identique mais à 0°C ; l’utilisation d’agents chimiques (antibiotiques, bactéricides) ou
physiques (chaleur, rayonnement gamma) ayant sur les bactéries des effets irréversibles.
Mesure de la radioactivité
Le
14 C-CO 2 est piégé sur le filtre par la phényléthylamine ; ce filtre, placé dans un flacon à
scintillation, est broyé dans 1 ml de méthanol afin de faciliter la dissolution du complexe
C02-phényléthylamine (Brown, 1979). Après addition de scintillant (PCS Amersham),
les flacons sont placés à l’obscurité pendant 12 heures afin d’atténuer la chimiluminescence. Les comptages sont effectués avec un compteur Beckman LS 1800 en utilisant
l’étalonnage externe pour corriger le quenching.
La mesure directe de la radioactivité du sédiment n’est pas possible en raison du quenching engendré par la fraction minérale ; pour pallier à cet inconvénient, la prise d’essai est
préalablement traitée dans un analyseur de carbone (Leco IR 212). Le C organique est
transformé en CO2 alors que les autres composés volatils sont entraînés par un courant
gazeux. A la sortie de l’appareil le CO2 est récupéré par barbottage dans un mélange
éthanolamine-éthyléther (2 : 8 vol/vol). La radioactivité est mesurée après addition de
scintillant.
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Whatmann. Les fioles sont groupées en 6 séries de 3 ; chaque série correspondant à une
durée d’incubation : 0,10,30,60,90 et 120 minutes. L’injection de la solution de
14 C-A.A.
marque le début de l’expérimentation (fig. 1). Après rinçage de l’aiguille par 0,5 ml d’eau
distillée, 0,2 ml de phényléthylamine (piège à CO2) sont injectés dans la coupelle portefiltre. A l’issue de la période d’incubation, les prélèvements pour les numérations bactériennes sont effectués. Puis l’addition de 5 ml de formol neutralisé à 10% arrête le
développement des microorganismes.
- l’acidification par HCl 2N provoque le dégagement du CO2 dissous dans la phase
aqueuse. Ceci permet une mesure plus juste de la partie du traceur ayant été “respirée”.
Les filtres sont alors prélevés et dosés (voir ci-dessous).
- le lavage du sédiment par HCl 2N (120 ml), suivi d’une centrifugation (2500 rpm
pendant 10 mn), est destiné à détacher les A. A. faiblement fixés au sédiment.
- le sédiment après ce lavage subit une hydrolyse acide par HCl 6N (à 106°C pendant
24 h). Cette opération a pour but d’hydrolyser les liaisons peptidiques et de permettre le
dosage des A. A. combinés.
Des témoins sont effectués à différents niveaux de ce protocole. Au temps 0 le formol est
injecté avant le traceur, ceci donne un “blanc”. Les phénomènes d’adsorption sont
contrôlés par un témoin sans sédiment, pour connaître l’adsorption parasite due à la fiole.
Ce dosage indique une adsorption négligeable de 1%. La fixation du
14 C-CO 2 est
également testée, grâce à une solution de
14 C-HCO 3
- dans les conditions de l’expérience
99,6% de la radioactivité est retrouvée sur le filtre imprégné de phényléthylamine. Un
autre témoin consiste à mesurer directement la radioactivité d’1 ml de la solution d’A.A.
marqués, utilisée lors des expériences. On obtient 1 900 000 d.p.m.
Afin d’opérer une distinction entre les phénomènes physico-chimiques d’adsorption et
l’activité biologique, nous avons bloqué le métabolisme bactérien en réalisant une opération identique mais à 0°C ; l’utilisation d’agents chimiques (antibiotiques, bactéricides) ou
physiques (chaleur, rayonnement gamma) ayant sur les bactéries des effets irréversibles.
Mesure de la radioactivité
Le
14 C-CO 2 est piégé sur le filtre par la phényléthylamine ; ce filtre, placé dans un flacon à
scintillation, est broyé dans 1 ml de méthanol afin de faciliter la dissolution du complexe
C02-phényléthylamine (Brown, 1979). Après addition de scintillant (PCS Amersham),
les flacons sont placés à l’obscurité pendant 12 heures afin d’atténuer la chimiluminescence. Les comptages sont effectués avec un compteur Beckman LS 1800 en utilisant
l’étalonnage externe pour corriger le quenching.
La mesure directe de la radioactivité du sédiment n’est pas possible en raison du quenching engendré par la fraction minérale ; pour pallier à cet inconvénient, la prise d’essai est
préalablement traitée dans un analyseur de carbone (Leco IR 212). Le C organique est
transformé en CO2 alors que les autres composés volatils sont entraînés par un courant
gazeux. A la sortie de l’appareil le CO2 est récupéré par barbottage dans un mélange
éthanolamine-éthyléther (2 : 8 vol/vol). La radioactivité est mesurée après addition de
scintillant.
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