formaldéhyde ( 10 %), est filtré, après homogénéisation (passage dans un bain à ultra-sons
pendant cinq minutes) sur une membrane Nuclépore de 0.2µm de porosité et de 25 mm de
diamètre, préalablement colorée en noir par trempage dans un bain d’Irgalan black (2 g/l
d’eau à 2 % d’acide acétique). Une meilleure répartition des cellules sur le filtre est obtenue
par l’emploi d’un préfiltre (Millipore de 0.2 µm de porosité et 25 mm de diamètre).
Les comptages directs en microscopie en immunofluorescence.
A partir des échantillons préalablement fixés au formaldéhyde (10 %), et après homogénéisation par passage pendant cinq minutes dans un bain à ultra-sons, un volume connu
est filtré sur membrane Nuclépore (porosité 0,2 µm, diamètre 25 mm). Les filtres sont
traités avant l’usage,de la même manière que pour les comptages en épifluorescence :
trempage dans un bain d’Irgalan black (2 g/l d’eau à 2 % d’acide acétique). Le filtre est
ensuite rincé trois fois avec 5 ml d’eau physiologique tamponnée (solution concentrée dix
fois, NaCl : 80g ; Na 2 HP0 4 ,12H 2 0 2 : 32.926g ; KH
2
P0
4
:1.088 g ; H
2
0 distillée : 1000ml).
Après filtration sous vide, 1 ml de gélatine (2 % dans l’eau physiologique tamponnée,
hydrolysée à pH 11 et 120°C pendant 15 minutes, puis neutralisée) est ajouté pour
neutraliser les sites ioniques et réduire la “background fluorescence” (Ward and Perry,
1980, Dahle and Laake, 1982). Après 20 minutes, l’excès de gélatine est éliminé par trois
rinçages avec 5 ml d’eau physiologique tamponnée. Deux ml de mélange nonavalent de
globulines fluorescentes anti-Escherichia coli (Institut Pasteur Production), diluées au
1 / 20 sont ensuite mis en contact avec le filtre pendant 20 à 30 minutes. Trois rinçages (5 ml
d’eau physiologique tamponnée) sont encore effectués. Après un bain du filtre pendant
dix minutes dans l’eau physiologique tamponnée, celui-ci est séché et monté entre lame et
lamelle.
L’observation se fait au microscope Olympus, objectif 100, sous lumière U.V.
En vue d’obtenir des témoins positifs, des examens ont été faits à partir de cultures des
sérotypes 026 B6 et 0111 B4 (inclus dans les 9 sérotypes du sérum utilisé) de Escherichia
coli (collection de l’Institut Pasteur). Les deux souches ont été mises en culture sur milieu
liquide (Nutrient broth DIFCO), et incubées à 37°C pendant 48 heures. A partir de ces
cultures, et toujours en vue de comparer les différentes méthodes utilisées, des ensemencements sur gélose nutritive et des comptages directs (épi et immunofluorescence) ont été
réalisés, dans des conditions identiques à celles des échantillons du milieu naturel.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
La figure 1 permet de comparer les trois méthodes de comptages utilisées pour la
numération des cellules des sérotypes 026 B6 et 0111 B4 de Escherichia coli en culture
pure.
Le nombre de cellules obtenu par comptage direct en épifluorescence est pratiquement
identique à celui obtenu par comptage direct en immunofluorescence. De tels résultats
sont à rapprocher de ceux de Huai-Shu Xu et coll. (1982) obtenus à partir d’une souche de
Escherichia coli (ATCC 25922) et une souche de Escherichia coli isolée d’eaux d’égouts.
Ces résultats confirment la possibilité de la mise en évidence, dans le milieu naturel, d’une
bactérie par le jeu des anticorps,comme celà a été démontré pour Rhizobium japonicum
dans le sol (Schmidt et coll., 1968), Thiobacillus ferrooxydans dans les environnements
acides (Apel et coll., 1976), des bactéries méthylotrophes (Redd et Dugan, 1978), ou pour
des souches isolées de l’eau de mer comme Aeromonas sp., Chromatobacterium lividum,
Pseudomonas sp., et Vibrio sp. (Dahle et Laake, 1982).
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pendant cinq minutes) sur une membrane Nuclépore de 0.2µm de porosité et de 25 mm de
diamètre, préalablement colorée en noir par trempage dans un bain d’Irgalan black (2 g/l
d’eau à 2 % d’acide acétique). Une meilleure répartition des cellules sur le filtre est obtenue
par l’emploi d’un préfiltre (Millipore de 0.2 µm de porosité et 25 mm de diamètre).
Les comptages directs en microscopie en immunofluorescence.
A partir des échantillons préalablement fixés au formaldéhyde (10 %), et après homogénéisation par passage pendant cinq minutes dans un bain à ultra-sons, un volume connu
est filtré sur membrane Nuclépore (porosité 0,2 µm, diamètre 25 mm). Les filtres sont
traités avant l’usage,de la même manière que pour les comptages en épifluorescence :
trempage dans un bain d’Irgalan black (2 g/l d’eau à 2 % d’acide acétique). Le filtre est
ensuite rincé trois fois avec 5 ml d’eau physiologique tamponnée (solution concentrée dix
fois, NaCl : 80g ; Na 2 HP0 4 ,12H 2 0 2 : 32.926g ; KH
2
P0
4
:1.088 g ; H
2
0 distillée : 1000ml).
Après filtration sous vide, 1 ml de gélatine (2 % dans l’eau physiologique tamponnée,
hydrolysée à pH 11 et 120°C pendant 15 minutes, puis neutralisée) est ajouté pour
neutraliser les sites ioniques et réduire la “background fluorescence” (Ward and Perry,
1980, Dahle and Laake, 1982). Après 20 minutes, l’excès de gélatine est éliminé par trois
rinçages avec 5 ml d’eau physiologique tamponnée. Deux ml de mélange nonavalent de
globulines fluorescentes anti-Escherichia coli (Institut Pasteur Production), diluées au
1 / 20 sont ensuite mis en contact avec le filtre pendant 20 à 30 minutes. Trois rinçages (5 ml
d’eau physiologique tamponnée) sont encore effectués. Après un bain du filtre pendant
dix minutes dans l’eau physiologique tamponnée, celui-ci est séché et monté entre lame et
lamelle.
L’observation se fait au microscope Olympus, objectif 100, sous lumière U.V.
En vue d’obtenir des témoins positifs, des examens ont été faits à partir de cultures des
sérotypes 026 B6 et 0111 B4 (inclus dans les 9 sérotypes du sérum utilisé) de Escherichia
coli (collection de l’Institut Pasteur). Les deux souches ont été mises en culture sur milieu
liquide (Nutrient broth DIFCO), et incubées à 37°C pendant 48 heures. A partir de ces
cultures, et toujours en vue de comparer les différentes méthodes utilisées, des ensemencements sur gélose nutritive et des comptages directs (épi et immunofluorescence) ont été
réalisés, dans des conditions identiques à celles des échantillons du milieu naturel.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
La figure 1 permet de comparer les trois méthodes de comptages utilisées pour la
numération des cellules des sérotypes 026 B6 et 0111 B4 de Escherichia coli en culture
pure.
Le nombre de cellules obtenu par comptage direct en épifluorescence est pratiquement
identique à celui obtenu par comptage direct en immunofluorescence. De tels résultats
sont à rapprocher de ceux de Huai-Shu Xu et coll. (1982) obtenus à partir d’une souche de
Escherichia coli (ATCC 25922) et une souche de Escherichia coli isolée d’eaux d’égouts.
Ces résultats confirment la possibilité de la mise en évidence, dans le milieu naturel, d’une
bactérie par le jeu des anticorps,comme celà a été démontré pour Rhizobium japonicum
dans le sol (Schmidt et coll., 1968), Thiobacillus ferrooxydans dans les environnements
acides (Apel et coll., 1976), des bactéries méthylotrophes (Redd et Dugan, 1978), ou pour
des souches isolées de l’eau de mer comme Aeromonas sp., Chromatobacterium lividum,
Pseudomonas sp., et Vibrio sp. (Dahle et Laake, 1982).
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