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Efflorescences toxiques des eaux c6tières françatses : kologie, kophysio/ogie, toxicologie
Les critères utilisés pour identifier et évaluer la
pureté de l' AO ont été :
• sa toxicité sur cellule KB (C l 50 voisine de
3 ng/ml} identique à celle du témoin possédé,
avec transformation des cellules caractéristiq ues
des inhibiteurs des protéines-phosphatases ;
• l'analyse chromatographique, après dérivation
par l'ADAM, qui montre un seul pic de même
temps de rétention que l' AO témoin et une pureté supérieure à celui-ci (plusieurs pics} ;
• la comparaison de son spectre de masse avec
celui publié en 1991 par Benesath et Dickey;
• l' absence de phtalates.
La DTX-1 , dont seulement des traces ont été préparées, n' a été évaluée que par son comportement vis-à-vis des cellules KB et son temps de
rétention chromatographique après dérivation,
identiques à ceux de la DTX-1 utilisée comme
témoin.
Le rendement en AO de l'extraction est particulièrement bon puisqu 'il avoisine 73 % de la
teneur des cellules de départ, avant la chromatographie de purification terminale.
Bien que I' AO et la DTX-1 ne se trouvent qu ' à
l'état de traces dans la matière première (environ
0,02 % par rapport au poids sec}, la méthode proposée ne fait appel qu'à cinq opérations majeures
(deux extractions liquide-liquide et trois chromatographies, la dernière devant être répétée plusieurs fois suivant le degré de pureté désiré) et est
aisée à mettre en œuvre.
Faisabilité de l'obtention
d'acide okadaïque à partir
de moules contaminées
La matière première étudiée a été constituée de
moules contaminées récoltées en juin 1988 dans
la région de Luc-sur-Mer (Normandie}. Une originalité de la méthode a été de s'adresser non pas
aux moules fraîches, mais aux moules cuites à la
vapeur puis écoquillées et enfin congelées. Cette
approche facilite l'obtention de la chair, ne provoque pas de diminution de la teneur en AO et
ne modifie pas ses conditions d'extraction ultérieures. Par contre il a été montré qu' une dessiccation (à 60 oc pendant deux jours} de la matière
première cuite (après décongélation} n'était pas
souhaitable, une perte en AO de l' ordre de 30%
étant alors constatée.
L'obtention de l' AO a été effectuée à partit des
hépatopancréas séparés après décongélation. La
chair résiduelle contenait une quantité non négligeable de I'AO total (# 30 %}, mais celui-ci s'y
trouvait à une concentration huit fois inférieure et
était plus difficilement extractible. Il est possible
que la présence inhabituelle de l' AO dans la chair
débarrassée de son hépatopancréas soit liée à la
cuisson.
L' extraction de l' AO des hépatopanc réas a été
effectuée en utilisant l' acétone comme sol vant.
Dans les conditions opératoires, une seule extraction suffit, permettant de récupérer 90 % de la toxicité totale et de ne pas conta miner l'extra t par
d'autres substances qui passeraient dans l'acétone
lors de nouvelles extractions du fait de la diminution de la teneur en eau de la matière première.
La phase de concentration des toxines a fait appel
à différentes méthodes classiques de séparation
liquide-liquide et de chromatographies sur silice,
sur Séphadex G25 et sur Séphadex LH20.
La phase ultime de purification a été réalisée,
comme précédemment, par chromatographie sur
silice greffée C18 (fig. 2, p. 141 ).
Les critères utilisés pou r identifier et éval uer la
pureté de l' AO ont été :
• la
1 H RMN, par comparaison avec un témoin ;
• l'analyse chromatographique, après dérivation
par l'ADAM, qui montre un pic de même temps
de rétention que l' AO de référence ;
• l'analyse chromatographique sans dérivation
sur C18 à l' aide du mélange MeOH-H20 1 :1 et
détection à 215 nm, qui montre également un pic
de même temps de rétention que I'AO ainsi que
l' absence d' autres substances absorbant à cette
longueur d'onde.
Quelle que fût la méthode employée, aucune trace d'impuretés n'a pu être décelée.
Efflorescences toxiques des eaux c6tières françatses : kologie, kophysio/ogie, toxicologie
Les critères utilisés pour identifier et évaluer la
pureté de l' AO ont été :
• sa toxicité sur cellule KB (C l 50 voisine de
3 ng/ml} identique à celle du témoin possédé,
avec transformation des cellules caractéristiq ues
des inhibiteurs des protéines-phosphatases ;
• l'analyse chromatographique, après dérivation
par l'ADAM, qui montre un seul pic de même
temps de rétention que l' AO témoin et une pureté supérieure à celui-ci (plusieurs pics} ;
• la comparaison de son spectre de masse avec
celui publié en 1991 par Benesath et Dickey;
• l' absence de phtalates.
La DTX-1 , dont seulement des traces ont été préparées, n' a été évaluée que par son comportement vis-à-vis des cellules KB et son temps de
rétention chromatographique après dérivation,
identiques à ceux de la DTX-1 utilisée comme
témoin.
Le rendement en AO de l'extraction est particulièrement bon puisqu 'il avoisine 73 % de la
teneur des cellules de départ, avant la chromatographie de purification terminale.
Bien que I' AO et la DTX-1 ne se trouvent qu ' à
l'état de traces dans la matière première (environ
0,02 % par rapport au poids sec}, la méthode proposée ne fait appel qu'à cinq opérations majeures
(deux extractions liquide-liquide et trois chromatographies, la dernière devant être répétée plusieurs fois suivant le degré de pureté désiré) et est
aisée à mettre en œuvre.
Faisabilité de l'obtention
d'acide okadaïque à partir
de moules contaminées
La matière première étudiée a été constituée de
moules contaminées récoltées en juin 1988 dans
la région de Luc-sur-Mer (Normandie}. Une originalité de la méthode a été de s'adresser non pas
aux moules fraîches, mais aux moules cuites à la
vapeur puis écoquillées et enfin congelées. Cette
approche facilite l'obtention de la chair, ne provoque pas de diminution de la teneur en AO et
ne modifie pas ses conditions d'extraction ultérieures. Par contre il a été montré qu' une dessiccation (à 60 oc pendant deux jours} de la matière
première cuite (après décongélation} n'était pas
souhaitable, une perte en AO de l' ordre de 30%
étant alors constatée.
L'obtention de l' AO a été effectuée à partit des
hépatopancréas séparés après décongélation. La
chair résiduelle contenait une quantité non négligeable de I'AO total (# 30 %}, mais celui-ci s'y
trouvait à une concentration huit fois inférieure et
était plus difficilement extractible. Il est possible
que la présence inhabituelle de l' AO dans la chair
débarrassée de son hépatopancréas soit liée à la
cuisson.
L' extraction de l' AO des hépatopanc réas a été
effectuée en utilisant l' acétone comme sol vant.
Dans les conditions opératoires, une seule extraction suffit, permettant de récupérer 90 % de la toxicité totale et de ne pas conta miner l'extra t par
d'autres substances qui passeraient dans l'acétone
lors de nouvelles extractions du fait de la diminution de la teneur en eau de la matière première.
La phase de concentration des toxines a fait appel
à différentes méthodes classiques de séparation
liquide-liquide et de chromatographies sur silice,
sur Séphadex G25 et sur Séphadex LH20.
La phase ultime de purification a été réalisée,
comme précédemment, par chromatographie sur
silice greffée C18 (fig. 2, p. 141 ).
Les critères utilisés pou r identifier et éval uer la
pureté de l' AO ont été :
• la
1 H RMN, par comparaison avec un témoin ;
• l'analyse chromatographique, après dérivation
par l'ADAM, qui montre un pic de même temps
de rétention que l' AO de référence ;
• l'analyse chromatographique sans dérivation
sur C18 à l' aide du mélange MeOH-H20 1 :1 et
détection à 215 nm, qui montre également un pic
de même temps de rétention que I'AO ainsi que
l' absence d' autres substances absorbant à cette
longueur d'onde.
Quelle que fût la méthode employée, aucune trace d'impuretés n'a pu être décelée.