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Efflorescences toxiques des eaux côti~res françaises :écologie, écophysiologie, tox icologie
Étude de la faisabilité
d'obtention de standards
de toxines diarrhéiques
à partir de cultures
de Prorocentrum lima
ou de moules contaminées
À l'origine de cette étude, la difficulté est de se procurer de l' acide okadaïque, principale toxine diarrhéique rencontrée en France dans les moules
contaminées, pour la mise en œuvre de tests de
détection et l'étude de ses propriétés biologiques
et toxicologiques. En effet, l' acide okadaïque a
d'abord été commercialisé, ponctuellement et à
un prix prohibitif, par un seul laboratoire situé à
Hawaï (Ëtats Unis), puis au Canada. Il a été possible de l'obtenir ultérieurement auprès de fournisseurs français. Par ailleurs, les analyses en RMN
réalisées dans le cadre du programme (M. Guyot)
ont permis de déceler, pour certains étalons, des
impuretés en proportions notables (de 20 % à
30 % d'autres produits) et la présence, à côté de
l' acide okadaïque et en quantité équivalente, d'un
autre composé de structure apparentée. À l' heure
actuelle, l'acide okadaïque commercialisé est de
me illeure qualité, mais reste encore un produit
cher (INC Biomédical : 13 300 FF H .T. le mg en
1996, pour une pureté annoncée de 98 %).
Deux études de fa isabi lité d'obtention de l'acide
okadaïque (AO) ont été menées parallèlement à
partir de cultures de Prorocentrum lima (pyrrophycophytes) et à partir de moules contaminées
par Dinophysis. P. lima présente l' intérêt de pouvoir être cu ltivé à la demande, alors que les
moules contaminées ne sont disponibles que de
façon aléatoire quelques mois par an. P. lima produit, à côté de l'acide okadaïque, des toxines assoc iées, principalement de la dinophysis-toxine-1
(DTX-1 ), qui peuvent nécessiter des étapes de purification supplémentaires, alors qu'en France, les
moules contaminées ne renferment que de l' acide
okadaïque. L'inconvénient peut toutefois se transformer en avantage si l'extraction vise également
l'obtention de la DTX-1. Celle-ci est en effet la
pri ncipa le toxine d iarrhéique des coqu ill ages
contaminés par Dinophysis sp. dans d'autres pays
comme le japon.
L' utilisation de Dinophysis comme matière première pour l' obtention des toxines diarrhéiques ne
pouvait, et ne peut toujours pas, être envisagée, la
cu lture de cette microalgue n'ayant jamais pu ètre
maîtrisée.
Faisabilité de l'obtention d'acide
okadaïque et de dinophysis-toxine-1
à partir de cultures de Prorocentrum
lima
Les cultures de P. lima utilisées pour ce travail ont
été réalisées à partir d' une souche isolée au large
de Vigo (Espagne) en août 1987 et référencée
PL2V. Sa production a été réalisée au sein du
laboratoire Phycotoxines et Nuisances de Nantes.
Cette souche présente un taux de croissance lent
(0,1 0 à 0,15 division/j) et sa production toxinique
est faib le (880 à 2300 ng A0/ 1 0 6 cellules). C'est
pourquoi des études furent entreprises afin d'améliorer les conditions de croissance/ production
d' AO (Morlaix et Lassus 1992). À coté de l' AO,
cette souche contient de la DTX-1 , dont la teneur
ne dépasse pas toutefois 15 % du mélange des
deux toxines.
Le but de cette étude n'était pas de produi re de
I'AO et de la DTX-1 , mais d'optimiser eurs
méthodes d' extraction, pour déterminer la faisabilité de leur obtention à partir de cette matière
première. Bien que les études concernant I'AO et
de la DTX-1 aient été réalisées de façon indépendante, les résultats obtenus seront présentés ici
de façon synthétique.
L' extraction a été réalisée à partir des corps cellulaires de P. lima recueillis sur un filtre de 5 ~met
éclatés par broyage mécanique (billes de verre) ou
par action des ultrasons dans le méthanol. L'acétone, solvant souvent employé à ce stade, a été
écarté, car étant moins sélectif vis-à-vis des substances à extraire et dissolvant donc une plus
grande quantité d' impuretés.
La phase de concentration des toxines a été l'occas ion de comparer différentes méthodes classiques de séparation liquide-liquide et de chromatographie sur silice, sur Séphadex LH20 ou sur
silice greffée C18 . La phase LH20 n'a pas été
conservée dans le protocole retenu, des pertes
notables en AO ayant été constatées lors de son
utilisation.
La phase ultime de purification et de séparation
de I'AO et de la DTX-1 a été assurée par chromatographie sur C18 (fig. 1 ).
Efflorescences toxiques des eaux côti~res françaises :écologie, écophysiologie, tox icologie
Étude de la faisabilité
d'obtention de standards
de toxines diarrhéiques
à partir de cultures
de Prorocentrum lima
ou de moules contaminées
À l'origine de cette étude, la difficulté est de se procurer de l' acide okadaïque, principale toxine diarrhéique rencontrée en France dans les moules
contaminées, pour la mise en œuvre de tests de
détection et l'étude de ses propriétés biologiques
et toxicologiques. En effet, l' acide okadaïque a
d'abord été commercialisé, ponctuellement et à
un prix prohibitif, par un seul laboratoire situé à
Hawaï (Ëtats Unis), puis au Canada. Il a été possible de l'obtenir ultérieurement auprès de fournisseurs français. Par ailleurs, les analyses en RMN
réalisées dans le cadre du programme (M. Guyot)
ont permis de déceler, pour certains étalons, des
impuretés en proportions notables (de 20 % à
30 % d'autres produits) et la présence, à côté de
l' acide okadaïque et en quantité équivalente, d'un
autre composé de structure apparentée. À l' heure
actuelle, l'acide okadaïque commercialisé est de
me illeure qualité, mais reste encore un produit
cher (INC Biomédical : 13 300 FF H .T. le mg en
1996, pour une pureté annoncée de 98 %).
Deux études de fa isabi lité d'obtention de l'acide
okadaïque (AO) ont été menées parallèlement à
partir de cultures de Prorocentrum lima (pyrrophycophytes) et à partir de moules contaminées
par Dinophysis. P. lima présente l' intérêt de pouvoir être cu ltivé à la demande, alors que les
moules contaminées ne sont disponibles que de
façon aléatoire quelques mois par an. P. lima produit, à côté de l'acide okadaïque, des toxines assoc iées, principalement de la dinophysis-toxine-1
(DTX-1 ), qui peuvent nécessiter des étapes de purification supplémentaires, alors qu'en France, les
moules contaminées ne renferment que de l' acide
okadaïque. L'inconvénient peut toutefois se transformer en avantage si l'extraction vise également
l'obtention de la DTX-1. Celle-ci est en effet la
pri ncipa le toxine d iarrhéique des coqu ill ages
contaminés par Dinophysis sp. dans d'autres pays
comme le japon.
L' utilisation de Dinophysis comme matière première pour l' obtention des toxines diarrhéiques ne
pouvait, et ne peut toujours pas, être envisagée, la
cu lture de cette microalgue n'ayant jamais pu ètre
maîtrisée.
Faisabilité de l'obtention d'acide
okadaïque et de dinophysis-toxine-1
à partir de cultures de Prorocentrum
lima
Les cultures de P. lima utilisées pour ce travail ont
été réalisées à partir d' une souche isolée au large
de Vigo (Espagne) en août 1987 et référencée
PL2V. Sa production a été réalisée au sein du
laboratoire Phycotoxines et Nuisances de Nantes.
Cette souche présente un taux de croissance lent
(0,1 0 à 0,15 division/j) et sa production toxinique
est faib le (880 à 2300 ng A0/ 1 0 6 cellules). C'est
pourquoi des études furent entreprises afin d'améliorer les conditions de croissance/ production
d' AO (Morlaix et Lassus 1992). À coté de l' AO,
cette souche contient de la DTX-1 , dont la teneur
ne dépasse pas toutefois 15 % du mélange des
deux toxines.
Le but de cette étude n'était pas de produi re de
I'AO et de la DTX-1 , mais d'optimiser eurs
méthodes d' extraction, pour déterminer la faisabilité de leur obtention à partir de cette matière
première. Bien que les études concernant I'AO et
de la DTX-1 aient été réalisées de façon indépendante, les résultats obtenus seront présentés ici
de façon synthétique.
L' extraction a été réalisée à partir des corps cellulaires de P. lima recueillis sur un filtre de 5 ~met
éclatés par broyage mécanique (billes de verre) ou
par action des ultrasons dans le méthanol. L'acétone, solvant souvent employé à ce stade, a été
écarté, car étant moins sélectif vis-à-vis des substances à extraire et dissolvant donc une plus
grande quantité d' impuretés.
La phase de concentration des toxines a été l'occas ion de comparer différentes méthodes classiques de séparation liquide-liquide et de chromatographie sur silice, sur Séphadex LH20 ou sur
silice greffée C18 . La phase LH20 n'a pas été
conservée dans le protocole retenu, des pertes
notables en AO ayant été constatées lors de son
utilisation.
La phase ultime de purification et de séparation
de I'AO et de la DTX-1 a été assurée par chromatographie sur C18 (fig. 1 ).