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Efflorescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophysiologie, toxicologie
sélection des fractions, celles-ci sont rassembl ées,
et la concentration en GTX2/GTX3 est déterminée
par CLHP, tout comme le niveau de pureté.
Il a été ainsi produit à un degré de pureté suffisant
pour les man ipulations de couplage organique
environ 4 mg soit 10 !JI moles de complexe
GTX2/GTX3.
La gonyautoxine GTX3 s'épimérise naturellement
pour donner une forme stable composée de GTX2
et de GTX3 à un rapport voisin de 5/1 respectivement. Ce processus est accéléré par chauffage de
la solution pendant 15 jours à 3 semaines dans
une étuve à 37 oc.
Expérimentation sur modèle saxitoxine
Compte tenu des contraintes de purification à réaliser pour le sujet GTX2/GTX3, il est apparu intéressant d' étudier au préalable sur le modèle expérimental (( saxitoxi ne commercialisée», la pertinence du protocole d'expérimentation choisi.
• Préparation de conjugués STX-porteurs
Le couplage est effectué selon la technique de Chu
et al. (1985) par utilisation de la form aldéhyde
comme agent de liaison NH2-NH2. Trois conjugués différents sont réalisés, deux conjugués STXBSA et STX-KLH pour les tests d' immunisati on et
un conjugué STX-PLL pour les tests de cribl age.
L' efficacité du couplage est vérifiée par la
recherche et le dosage dans les premiers bains de
dialyse de saxitoxine non liée. Les rapports de couplage STX/porteurs calculés correspondent aux
résultats précédemment décrits dans la littérature.
• Immunisation
Dans une première expérimentation, des sou ris
Balb/C ont été immunisées et rappelées à des doses
sub-létales avec les conjugués STX-BSA et STX-KLH
selon les protocoles classiqu es, dans un premier
temps en présence d'adjuvant complet de Freund
puis, dans un second temps en adjuvant incomplet, dans les coussinets plantaires des souris.
Dans une deuxième expérimentation, les deux
espèces souris et lapins ont été immunisées avec
les mêmes conjugués, à des doses bien inférieures
à la première expérimentation. Il a été observé
une mortalité précoce et élevée d es animaux,
supérieure à 50 % de l'effectif, surtout avec le
conjugué STX-KLH, et cela bien avant de présenter des anticorps anti-saxitoxine.
Quelle que soit l'espèce animale, les essais montrent que le conjugué STX-BSA est plus immunogène que le conjugué STX-KLH , mais que les anticorps produits ne sont pas spécifiques de la saxitoxine mais plutôt de la BSA et particulièrement
des groupements lysine de la BSA.
lnhibileurs: STX el GTX2/GTX3
075 D.O
.. ········ ················· • ··················· ··········
.....
.... . . ·
050
... ·
0.25
- - STX
0 ~~----~----~----~----_.----~----~----~--~
··A ·· GTX2/GTX3
100
10
0 1
0.01
0.001
0.0001
0 00001
Inhibiteur en ng/ ml
Figure 8- Courbes d'inhibition de l 'anticorps de lapin immunisé avec STX-KLH.
Efflorescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophysiologie, toxicologie
sélection des fractions, celles-ci sont rassembl ées,
et la concentration en GTX2/GTX3 est déterminée
par CLHP, tout comme le niveau de pureté.
Il a été ainsi produit à un degré de pureté suffisant
pour les man ipulations de couplage organique
environ 4 mg soit 10 !JI moles de complexe
GTX2/GTX3.
La gonyautoxine GTX3 s'épimérise naturellement
pour donner une forme stable composée de GTX2
et de GTX3 à un rapport voisin de 5/1 respectivement. Ce processus est accéléré par chauffage de
la solution pendant 15 jours à 3 semaines dans
une étuve à 37 oc.
Expérimentation sur modèle saxitoxine
Compte tenu des contraintes de purification à réaliser pour le sujet GTX2/GTX3, il est apparu intéressant d' étudier au préalable sur le modèle expérimental (( saxitoxi ne commercialisée», la pertinence du protocole d'expérimentation choisi.
• Préparation de conjugués STX-porteurs
Le couplage est effectué selon la technique de Chu
et al. (1985) par utilisation de la form aldéhyde
comme agent de liaison NH2-NH2. Trois conjugués différents sont réalisés, deux conjugués STXBSA et STX-KLH pour les tests d' immunisati on et
un conjugué STX-PLL pour les tests de cribl age.
L' efficacité du couplage est vérifiée par la
recherche et le dosage dans les premiers bains de
dialyse de saxitoxine non liée. Les rapports de couplage STX/porteurs calculés correspondent aux
résultats précédemment décrits dans la littérature.
• Immunisation
Dans une première expérimentation, des sou ris
Balb/C ont été immunisées et rappelées à des doses
sub-létales avec les conjugués STX-BSA et STX-KLH
selon les protocoles classiqu es, dans un premier
temps en présence d'adjuvant complet de Freund
puis, dans un second temps en adjuvant incomplet, dans les coussinets plantaires des souris.
Dans une deuxième expérimentation, les deux
espèces souris et lapins ont été immunisées avec
les mêmes conjugués, à des doses bien inférieures
à la première expérimentation. Il a été observé
une mortalité précoce et élevée d es animaux,
supérieure à 50 % de l'effectif, surtout avec le
conjugué STX-KLH, et cela bien avant de présenter des anticorps anti-saxitoxine.
Quelle que soit l'espèce animale, les essais montrent que le conjugué STX-BSA est plus immunogène que le conjugué STX-KLH , mais que les anticorps produits ne sont pas spécifiques de la saxitoxine mais plutôt de la BSA et particulièrement
des groupements lysine de la BSA.
lnhibileurs: STX el GTX2/GTX3
075 D.O
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050
... ·
0.25
- - STX
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··A ·· GTX2/GTX3
100
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0 1
0.01
0.001
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Inhibiteur en ng/ ml
Figure 8- Courbes d'inhibition de l 'anticorps de lapin immunisé avec STX-KLH.