Chimie analyrique
................................................................................................................................
Ajouté (a)
Repli cats
Trouvé (b)
Écart/valeurs
Échantillons
(ng/ml)
(moyenne ± SD
attendues
en ng/ml)
(a-b)/a en %
AO +extra it brut
40
2
41
±13
+2
de moules
80
2
77,5 ± 4,5
-3
(MeOH 70 %)
160
2
177,5 ± 26,5
+10,9
320
2
338,5 ± 9,5
+5,8
AO +extrait
100
3
101 ± 7,5
+1
de moules
200
3
190 ± 16,8
-5
semi-purifié
400
3
384,2 ± 6,3
-3,9
(MeOH)
800
3
742, 1 ± 5,5
-7,2
Témoin AO
40
2
48 ±11
+20
dans le méthanol
80
2
82,5 ± 28,5
+3,1
160
2
175,5 ± 10,5
+9,7
320
2
325,5 ± 4,5
+ 1,7
AO + eau de mer
14
2
14,4 ± 2
+2,8
28
2
28,4 ± 0,5
+ 1,4
Témoin AO
14
2
14,4 ± 1
+2,8
dans un tampon
28
2
26,9 ± 4
-3,9
Tableau 4 - Dosage de I'AO ajouté à différents échantillons par le test d 'inhibition phosphatase-pNPP.
Méthodes immunologiques
Mise au point de tests immunologiques de détection des gonyautoxines GTX2/GTX3
La souche d' Alexandrium minutum sévissant le
long des côtes françaises a un profil toxinique
principalement composé des GTX2/GTX3. Cette
particularité a orienté les travaux sur la mise au
point de tests immunologiques de détection de
ces deux contaminants, comme techniques alternatives aux bioessais. Les gonyautoxines, comme
toutes les biotoxines paralysantes ne sont pas
immunogéniques, il est donc nécessaire de les
coupler à des molécules porteuses avant l' immunisation des animaux. De plus, contrairement à
la saxitoxine, celles-ci ne sont pas commercialisées. Il est donc impératif, en préalable aux essais
d'immunisation, de les produire et de les purifier
en quantité et avec une pureté satisfaisante pour
les tests à entreprendre.
Purification du complexe GTX2/GTX3
La production d'extrait toxinique est effectué à
IFREMER/Nantes, par la culture en masse in vitro
du clone MOG 835, d'A. tamarense, sur milieu ES
Provasoli (Morlaix, 1992). Les cellules récupérées
sont soniquées et chauffées à 1 00 oc durant 5 à
10 minutes en milieu acide chlorhydrique 0,1 N
privilégiant ainsi la formation des GTX2/GTX3 .
L'ensemble est ensuite centrifugé et l'extrait toxinique est récupéré. Les gonyautoxines sont ensuite sélectionnées et purifiées à partir de l'extrait tox inique par différentes techniques préparatives de
chromatographie, selon C. Lapeyre et al. (1991 ).
Succinctement, l'extrait toxinique est concentré
par lyophylisation, puis repris dans un minimum
de solution de CH3 COOH 1 mM pH 4,2 et déprotéiné sélectivement par chromatographie de perméation de gel sur une résine Séphacryl S 100 HR
(Pharmacia). Après analyse par CLHP, les fractions
contenant les GTX2/GTX3 sont rassemblées et
purifiées par FPLC sur une colonne échangeuse de
cations forts Mono S 1 0/1 0 (Pharmacia). Après
129
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Ajouté (a)
Repli cats
Trouvé (b)
Écart/valeurs
Échantillons
(ng/ml)
(moyenne ± SD
attendues
en ng/ml)
(a-b)/a en %
AO +extra it brut
40
2
41
±13
+2
de moules
80
2
77,5 ± 4,5
-3
(MeOH 70 %)
160
2
177,5 ± 26,5
+10,9
320
2
338,5 ± 9,5
+5,8
AO +extrait
100
3
101 ± 7,5
+1
de moules
200
3
190 ± 16,8
-5
semi-purifié
400
3
384,2 ± 6,3
-3,9
(MeOH)
800
3
742, 1 ± 5,5
-7,2
Témoin AO
40
2
48 ±11
+20
dans le méthanol
80
2
82,5 ± 28,5
+3,1
160
2
175,5 ± 10,5
+9,7
320
2
325,5 ± 4,5
+ 1,7
AO + eau de mer
14
2
14,4 ± 2
+2,8
28
2
28,4 ± 0,5
+ 1,4
Témoin AO
14
2
14,4 ± 1
+2,8
dans un tampon
28
2
26,9 ± 4
-3,9
Tableau 4 - Dosage de I'AO ajouté à différents échantillons par le test d 'inhibition phosphatase-pNPP.
Méthodes immunologiques
Mise au point de tests immunologiques de détection des gonyautoxines GTX2/GTX3
La souche d' Alexandrium minutum sévissant le
long des côtes françaises a un profil toxinique
principalement composé des GTX2/GTX3. Cette
particularité a orienté les travaux sur la mise au
point de tests immunologiques de détection de
ces deux contaminants, comme techniques alternatives aux bioessais. Les gonyautoxines, comme
toutes les biotoxines paralysantes ne sont pas
immunogéniques, il est donc nécessaire de les
coupler à des molécules porteuses avant l' immunisation des animaux. De plus, contrairement à
la saxitoxine, celles-ci ne sont pas commercialisées. Il est donc impératif, en préalable aux essais
d'immunisation, de les produire et de les purifier
en quantité et avec une pureté satisfaisante pour
les tests à entreprendre.
Purification du complexe GTX2/GTX3
La production d'extrait toxinique est effectué à
IFREMER/Nantes, par la culture en masse in vitro
du clone MOG 835, d'A. tamarense, sur milieu ES
Provasoli (Morlaix, 1992). Les cellules récupérées
sont soniquées et chauffées à 1 00 oc durant 5 à
10 minutes en milieu acide chlorhydrique 0,1 N
privilégiant ainsi la formation des GTX2/GTX3 .
L'ensemble est ensuite centrifugé et l'extrait toxinique est récupéré. Les gonyautoxines sont ensuite sélectionnées et purifiées à partir de l'extrait tox inique par différentes techniques préparatives de
chromatographie, selon C. Lapeyre et al. (1991 ).
Succinctement, l'extrait toxinique est concentré
par lyophylisation, puis repris dans un minimum
de solution de CH3 COOH 1 mM pH 4,2 et déprotéiné sélectivement par chromatographie de perméation de gel sur une résine Séphacryl S 100 HR
(Pharmacia). Après analyse par CLHP, les fractions
contenant les GTX2/GTX3 sont rassemblées et
purifiées par FPLC sur une colonne échangeuse de
cations forts Mono S 1 0/1 0 (Pharmacia). Après
129