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ff(/orescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophys iologie, toxicologie
- cette activité pNPP-phosphatase exercée par les
PP est sensible à l' inhibition par l' AO de la même
façon que l' activité protéine phosphatase (Takai &
' Mieskes, 1991 ).
Un extrait semi-purifié di lué de phosphatase suffit
donc pour doser l'activité pNPP phosphatase AO
sensible puisqu'elle est due à la PP2A essentiellement. La mesure du taux d'inhibition de cette activité engendré par des extraits de moules contenant I'AO est fonction de la teneur en AO et une
courbe d'étalonnage peut être établie.
La réaction est la suivante :
pNPP
AO
pNP + P
..
incolore PP2Ac coloré ou jaune
pH 8,5
La formation du pNP est suivie par colorimétrie à
405 nm.
La PP2A-c n'étant pas disponible dans le commerce, il a été choisi de la purifier à partir du
muscle squelettique de lapin selon la méthode de
Cohen et ses collaborateurs (Cohen et al., 1988).
L' activité pNPP phosphatase a été calculée en
1-1mol de produit/min (1 1-1mol/min ; 1 U - unité
internationale) grâce au coefficient d' extinction
molaire du pNPP à l'aide de la loi de Beer-Lambert (00/ min;s.l.c).
0,1
Pour étudier la faisabilité du dosage l a courbe
représentant l'activité pNPP-phosphatase relative
en fon ction de différentes quantités d' AO standard a été établie (fig. 7). L' activité de référence
100 % étant l' activ ité pNPP-phosphatase déterminée en absence d' AO suivant, ici encore, le
protocole standard (Simon et Vernoux, 1994).
Les résultats de l'activité enzymatique relative en
fonction des différentes concentrations d' AO montrent que la courbe obtenue peut être assimi lée à
une droite pour une certaine portion de la courbe
qui correspond à des activités relatives s' étalant de
100 % à env iron 35-40%. Cette courbe est dépendante des quantités d' enzymes ajoutées dans le
milieu de réaction.
Une quantité intermédiaire d ' enzyme (4 0 1-11 -
60 fJI ) fut utilisée pour tester les échantillons
contenant de l' AO. Ces échantillons ont consisté
en extraits bruts ou sem i-purifiés de mou les ou
d 'eau de mer supplémentés avec des quantités
connues de AO étalon (tabl. 4, p. 129). Des essais
compl émentaires utilisant des échantill ons de
moules naturellement contaminées sont en cours.
Une approche de miniaturisation et automatisation du test avec l' utilisation de microplaques est
également entreprise actuellement.
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 (AO in ng/ml)
0+-~~~~~~~~~~~~~~~+-~-r~~~~~~~~~~~~
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4 ( AO in nM )
C(_)ncentration
Figure 7: Courbes de calibration pour le dosage de I'AO par inhibition des protéines phosphatases (quantités d'enzyme variant de
20 à 80 !JI).
ff(/orescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophys iologie, toxicologie
- cette activité pNPP-phosphatase exercée par les
PP est sensible à l' inhibition par l' AO de la même
façon que l' activité protéine phosphatase (Takai &
' Mieskes, 1991 ).
Un extrait semi-purifié di lué de phosphatase suffit
donc pour doser l'activité pNPP phosphatase AO
sensible puisqu'elle est due à la PP2A essentiellement. La mesure du taux d'inhibition de cette activité engendré par des extraits de moules contenant I'AO est fonction de la teneur en AO et une
courbe d'étalonnage peut être établie.
La réaction est la suivante :
pNPP
AO
pNP + P
..
incolore PP2Ac coloré ou jaune
pH 8,5
La formation du pNP est suivie par colorimétrie à
405 nm.
La PP2A-c n'étant pas disponible dans le commerce, il a été choisi de la purifier à partir du
muscle squelettique de lapin selon la méthode de
Cohen et ses collaborateurs (Cohen et al., 1988).
L' activité pNPP phosphatase a été calculée en
1-1mol de produit/min (1 1-1mol/min ; 1 U - unité
internationale) grâce au coefficient d' extinction
molaire du pNPP à l'aide de la loi de Beer-Lambert (00/ min;s.l.c).
0,1
Pour étudier la faisabilité du dosage l a courbe
représentant l'activité pNPP-phosphatase relative
en fon ction de différentes quantités d' AO standard a été établie (fig. 7). L' activité de référence
100 % étant l' activ ité pNPP-phosphatase déterminée en absence d' AO suivant, ici encore, le
protocole standard (Simon et Vernoux, 1994).
Les résultats de l'activité enzymatique relative en
fonction des différentes concentrations d' AO montrent que la courbe obtenue peut être assimi lée à
une droite pour une certaine portion de la courbe
qui correspond à des activités relatives s' étalant de
100 % à env iron 35-40%. Cette courbe est dépendante des quantités d' enzymes ajoutées dans le
milieu de réaction.
Une quantité intermédiaire d ' enzyme (4 0 1-11 -
60 fJI ) fut utilisée pour tester les échantillons
contenant de l' AO. Ces échantillons ont consisté
en extraits bruts ou sem i-purifiés de mou les ou
d 'eau de mer supplémentés avec des quantités
connues de AO étalon (tabl. 4, p. 129). Des essais
compl émentaires utilisant des échantill ons de
moules naturellement contaminées sont en cours.
Une approche de miniaturisation et automatisation du test avec l' utilisation de microplaques est
également entreprise actuellement.
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 (AO in ng/ml)
0+-~~~~~~~~~~~~~~~+-~-r~~~~~~~~~~~~
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0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4 ( AO in nM )
C(_)ncentration
Figure 7: Courbes de calibration pour le dosage de I'AO par inhibition des protéines phosphatases (quantités d'enzyme variant de
20 à 80 !JI).