• Le couplage avec le réactif fluorescent n' est que
partiel et les conditions de couplage doivent être
revues ou bien il faut utiliser un autre réactif fluorescent plus approprié ;
• Parmi différentes ciguatoxines, seules certaines
d'entre elles ont une fonction OH primaire accessible au réactif de couplage.
Des informations supplémentaires sont obtenues
si on prend soin de travailler toujours avec les
mêmes ciguatoxines, c'est-à-di re avec le même
extrait mais en utilisant des quantités différentes
de celu i-c i. Les résultats montrent alors que la
sensibil ité est de l'ordre de 1 Usg (c'est-à-di re du
ng) mais il n'y a pas de relation linéaire quantitative qui permettrait un dosage précis par la seule
évaluation de la surface du pic. Cela montre que
c ' est certainement le réactif de couplage et/ou
la méthode mise au point qui n' a pas l'efficacité
souhaitée.
Utilisation d'un hémisuccinate pour la
dérivation à l'aide de l'ADAM
Devant les problèmes posés par la dérivation avec
l' anthroyl nitrile l'idée de faire apparaître un groupement acide dans les molécules de ciguatoxines
a été retenue. L'an hydride succinique est utilisé
pour estérifier l' OH primaire des CTX. Il y a donc
apparition d' une fo nction -COOH libre. O n se
retrouve dans le cas bien connu du dosage de
l'ac ide okadaïque par fluorescence à l' aide du
réactif ADAM (9-Anthroyl Di Azo Méthane) (Lee
et al., 1987).
Néanmoins, lors de l'analyse de ce nouveau type
de dérivé, aucun résultat positif n' a pu être obtenu. Il semblerait que l' hémisuccinate de CTX soit
détruit en milieu aqueux d'après les immunologistes travaillant sur les mêmes produits. Or le solvant d' élution utilisé en CLHP était l'acéton itrileeau. Les essais n' ont cependant pas été poussés
p lu s lo in lorsque divers essais coupl és à une
détection biologique chez la souri s ont montré
que certaines c iguatoxines étaient déjà réduites
quantitativement par simple passage à 85 oc dans
la pyridine, pendant 2 heures.
Chimie analytique
Dosage biochimique
de l'acide okadaique
par inhibition
des phosphatases cibles
L'acide okadaïque (AO) est la princ ipale tox ine
diarrhéique présente dans les moules des côtes
françaises contaminées par Dinophysis (Ma rcai llou et Masselin, 1 990) . Ce résultat correspond
aux travaux effectués par Kumagaï et al., en 1 986
sur des moules de même provenance. Il semble
donc y avoir une stabilité du profil toxinique au
cou rs des années. Comme l' AO est un puissant
promoteur tumoral de type non-TPA (Suganuma
et al. , 1988), son dépistage devient obligatoire
pour l' hygiène publique.
Au niveau moléculaire, le mode d'action de I'AO
est une inhibition spécifique de 3 des 4 grandes
fami lles de protéines phosphatases (Bialojan et
al., 1988) : les PP1, PP2A et PP2B. Ces enzymes
sont impliquées dans les mécanismes de contrôle
des événements cellulaires du type déphosphorylation des protéines sur leurs rés idus sérine et
thréonine (Cohen, 1990). Cette aptitude a été utilisée pour la mise au point du dosage de I'AO dans
des coq uillages contam inés. La méthode de
Holmes (1991) prévoit la détermination du taux
d' inhition des PP1 et PP2 en présence d' extraits
de moules contaminées par I' AO, pu ri fiés par
CLHP avec l' utilisation, comme substrat des PP,
d' un produit radioactif. L'emploi de ce réactif
rad ioactif ne semble pas du tout adapté à des analyses de routine. Dans ce travail, une méthode plus
simple est proposée, qui utilise la spécificité réactionnelle de l' AO vis-à-vis de certaines PP dans des
conditions bien définies.
Le principe du dosage repose sur quelques propriétés caractéristiques des PP :
- les PP1 , PP2A et PP2B sont sensibles à l' inh ibition par l' AO et en particulier la PP2A au moins
100 fois plus que les autres (Bialojan et al. 1988) ;
- les PP sont capables in vitro de déphosphoryler à
côté des substrats protéiques classiques des substrats non protéiques de faible poids moléculaire
comme le paranitro phénylphosphate (pNPP) (Li,
1992 ; Takai et Mieskes, 1991) et les PP2A sont 100
fois plus actives sur ce substrat que les autres PP ;
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partiel et les conditions de couplage doivent être
revues ou bien il faut utiliser un autre réactif fluorescent plus approprié ;
• Parmi différentes ciguatoxines, seules certaines
d'entre elles ont une fonction OH primaire accessible au réactif de couplage.
Des informations supplémentaires sont obtenues
si on prend soin de travailler toujours avec les
mêmes ciguatoxines, c'est-à-di re avec le même
extrait mais en utilisant des quantités différentes
de celu i-c i. Les résultats montrent alors que la
sensibil ité est de l'ordre de 1 Usg (c'est-à-di re du
ng) mais il n'y a pas de relation linéaire quantitative qui permettrait un dosage précis par la seule
évaluation de la surface du pic. Cela montre que
c ' est certainement le réactif de couplage et/ou
la méthode mise au point qui n' a pas l'efficacité
souhaitée.
Utilisation d'un hémisuccinate pour la
dérivation à l'aide de l'ADAM
Devant les problèmes posés par la dérivation avec
l' anthroyl nitrile l'idée de faire apparaître un groupement acide dans les molécules de ciguatoxines
a été retenue. L'an hydride succinique est utilisé
pour estérifier l' OH primaire des CTX. Il y a donc
apparition d' une fo nction -COOH libre. O n se
retrouve dans le cas bien connu du dosage de
l'ac ide okadaïque par fluorescence à l' aide du
réactif ADAM (9-Anthroyl Di Azo Méthane) (Lee
et al., 1987).
Néanmoins, lors de l'analyse de ce nouveau type
de dérivé, aucun résultat positif n' a pu être obtenu. Il semblerait que l' hémisuccinate de CTX soit
détruit en milieu aqueux d'après les immunologistes travaillant sur les mêmes produits. Or le solvant d' élution utilisé en CLHP était l'acéton itrileeau. Les essais n' ont cependant pas été poussés
p lu s lo in lorsque divers essais coupl és à une
détection biologique chez la souri s ont montré
que certaines c iguatoxines étaient déjà réduites
quantitativement par simple passage à 85 oc dans
la pyridine, pendant 2 heures.
Chimie analytique
Dosage biochimique
de l'acide okadaique
par inhibition
des phosphatases cibles
L'acide okadaïque (AO) est la princ ipale tox ine
diarrhéique présente dans les moules des côtes
françaises contaminées par Dinophysis (Ma rcai llou et Masselin, 1 990) . Ce résultat correspond
aux travaux effectués par Kumagaï et al., en 1 986
sur des moules de même provenance. Il semble
donc y avoir une stabilité du profil toxinique au
cou rs des années. Comme l' AO est un puissant
promoteur tumoral de type non-TPA (Suganuma
et al. , 1988), son dépistage devient obligatoire
pour l' hygiène publique.
Au niveau moléculaire, le mode d'action de I'AO
est une inhibition spécifique de 3 des 4 grandes
fami lles de protéines phosphatases (Bialojan et
al., 1988) : les PP1, PP2A et PP2B. Ces enzymes
sont impliquées dans les mécanismes de contrôle
des événements cellulaires du type déphosphorylation des protéines sur leurs rés idus sérine et
thréonine (Cohen, 1990). Cette aptitude a été utilisée pour la mise au point du dosage de I'AO dans
des coq uillages contam inés. La méthode de
Holmes (1991) prévoit la détermination du taux
d' inhition des PP1 et PP2 en présence d' extraits
de moules contaminées par I' AO, pu ri fiés par
CLHP avec l' utilisation, comme substrat des PP,
d' un produit radioactif. L'emploi de ce réactif
rad ioactif ne semble pas du tout adapté à des analyses de routine. Dans ce travail, une méthode plus
simple est proposée, qui utilise la spécificité réactionnelle de l' AO vis-à-vis de certaines PP dans des
conditions bien définies.
Le principe du dosage repose sur quelques propriétés caractéristiques des PP :
- les PP1 , PP2A et PP2B sont sensibles à l' inh ibition par l' AO et en particulier la PP2A au moins
100 fois plus que les autres (Bialojan et al. 1988) ;
- les PP sont capables in vitro de déphosphoryler à
côté des substrats protéiques classiques des substrats non protéiques de faible poids moléculaire
comme le paranitro phénylphosphate (pNPP) (Li,
1992 ; Takai et Mieskes, 1991) et les PP2A sont 100
fois plus actives sur ce substrat que les autres PP ;
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