114
Efilorescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophysiologie, toxicologie
quantité limite de saponine standard au-delà de
laquelle le phénomène d' hémolyse est très amplifié. Si une substance hémolytique est présente en
trop faible quantité (inférieure à l'équivalent de
1 600 unités hémolytiques (UH) de saponine/])
pour être détectée directement, la quantité limite
ajoutée va produire un effet amplifié par rapport
à l' hémolyse normalement observée.
Dans des conditions d' incubation particulières la
pente de la courbe sigmoïde de la réaction diminue et, si la molécule hémolytique du milieu est de
même nature chimique que la saponine (ou tout
autre standard hémolytique utilisé), la méthode
devient quantitative sur des concentrations équivalentes à 2 000-6 000 UH/1 de saponine.
Une variante de ce test hémolytique a été appliquée en utilisant des hématies de cheval (fournies par Pasteur-Sanofi). Ces cellules se révèlent
plus sensibles et les tests réalisés sont plus intéressants car la limite inférieure de détection des
substances hémolytiques est abaissée.
La méthode utilisée pour la préparation des cellules sanguines de cheval est la même que pour
celles de mouton. Le protocole expérimental reste
identique. Une comparaison des réponses obtenues avec la saponine a été faite sur des globules
rouges de mouton, truite et c heval. Les résultats
ont montré que la réponse des globules rouges de
truite est détectable à partir de 400 UH/1, tandis
que les globu les rouges de cheval réagissent dès
200 UH/ 1. De plus, ces derniers tendent vers une
réponse linéaire et non plus sigmoïde comme les
deux autres types de cel lules, ce qui amél iore l' estimation quantitative de la capacité hémolytique
de l'échantillon testé.
La détection des ichtyotoxines hydrosolubles par
le test hémolytique a été comparée à deux autres
tests biologiques :
- le bioessai sur diatomée: plus sensible mais plus
long. Il peut être appliqué directement sur une
eau de mer ayant contenu des algues ichtyotoxiques, et il a été démontré que la présence de
10 4 cellules de Cymnodinium cf. nagasakiense
par litre réprime la croissance de la diatomée
Chaetoceros gracile de façon appréciable (Arzul
et al., 1993). Il faut cependant remarquer que
dans le cas de l'ichtyotoxine de Heterosigma carterae détectable par sa propriété hémolytique, le
bioessa i sur diatomée ne répond pas car cette
toxine n' a pas les mêmes propriétés allélopathiques que C. cf. nagasakiense ;
- le test Microtox : moins sensible que le précédent car il ne peut être utilisé directement su r
l'eau en raison de la trop grande dilution des substances toxiques. Il peut être amélioré par concentration de celle-ci, sur cartouches Sep-Pak Floris il
(Mill ipore) par exemple dans le cas de C. cf. nagasakiense, suivie d' une élution par solvants appropriés. C'est un test rapide car les résultats peuvent
être appréciés après 5 minutes d' incubation, mais
il nécessite la préparation de l'échantillon ;
- le test sur hématies de cheval se montre le plus
performant car il est à la fois relati vement rapide
(2 heures environ), et sensible par rapport au
Microtox. Il présente l'avantage d'être applicable
directement sur l'eau de mer diluée à 0,9 % de
salinité, et nécessite un appareillage simple.
Le test hémolytique est donc applicable à la
détection de substances au x propriétés cytolytiques présentes dans l'eau, susceptibles de nuire
aux organismes aquatiques en raison de ces propriétés. De nombreuses substances ont la propriété de lyser les membranes cellulaires ou d'en
modifier la perméabilité, et leur mode d'action est
différent selon leur nature ; cela ne permet pas
d'utiliser l' additivité de leurs effets. La méthode
est donc considérée comme une technique indicatrice de la présence de substances hémolytiques, même à faible concentration. Ell e ne
devient quantitative que lorsque la nature de la
substance recherchée est la même que celle du
standard utilisé comme référence.
Détection de la maïtotoxine
La maïtotoxine (MTX) est la toxine principale produite par un dinoflagellé benthique vivant dans les
eaux tropicales : Cambierdiscus toxicus. Sa structure a été récemment décrite par Murata et al.,
1993. Parmi les phycotoxines connues, c'est la
substance la plus puissante, elle provoque, entre
autres effets, une augmentation de la conce !ration intracellulaire en calcium libre et en inositotriphosphate (IP3).
Elle induit rapidement des perturbations du cytosquelette et de la forme cellu la ire(« macrobl ebb-
Efilorescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophysiologie, toxicologie
quantité limite de saponine standard au-delà de
laquelle le phénomène d' hémolyse est très amplifié. Si une substance hémolytique est présente en
trop faible quantité (inférieure à l'équivalent de
1 600 unités hémolytiques (UH) de saponine/])
pour être détectée directement, la quantité limite
ajoutée va produire un effet amplifié par rapport
à l' hémolyse normalement observée.
Dans des conditions d' incubation particulières la
pente de la courbe sigmoïde de la réaction diminue et, si la molécule hémolytique du milieu est de
même nature chimique que la saponine (ou tout
autre standard hémolytique utilisé), la méthode
devient quantitative sur des concentrations équivalentes à 2 000-6 000 UH/1 de saponine.
Une variante de ce test hémolytique a été appliquée en utilisant des hématies de cheval (fournies par Pasteur-Sanofi). Ces cellules se révèlent
plus sensibles et les tests réalisés sont plus intéressants car la limite inférieure de détection des
substances hémolytiques est abaissée.
La méthode utilisée pour la préparation des cellules sanguines de cheval est la même que pour
celles de mouton. Le protocole expérimental reste
identique. Une comparaison des réponses obtenues avec la saponine a été faite sur des globules
rouges de mouton, truite et c heval. Les résultats
ont montré que la réponse des globules rouges de
truite est détectable à partir de 400 UH/1, tandis
que les globu les rouges de cheval réagissent dès
200 UH/ 1. De plus, ces derniers tendent vers une
réponse linéaire et non plus sigmoïde comme les
deux autres types de cel lules, ce qui amél iore l' estimation quantitative de la capacité hémolytique
de l'échantillon testé.
La détection des ichtyotoxines hydrosolubles par
le test hémolytique a été comparée à deux autres
tests biologiques :
- le bioessai sur diatomée: plus sensible mais plus
long. Il peut être appliqué directement sur une
eau de mer ayant contenu des algues ichtyotoxiques, et il a été démontré que la présence de
10 4 cellules de Cymnodinium cf. nagasakiense
par litre réprime la croissance de la diatomée
Chaetoceros gracile de façon appréciable (Arzul
et al., 1993). Il faut cependant remarquer que
dans le cas de l'ichtyotoxine de Heterosigma carterae détectable par sa propriété hémolytique, le
bioessa i sur diatomée ne répond pas car cette
toxine n' a pas les mêmes propriétés allélopathiques que C. cf. nagasakiense ;
- le test Microtox : moins sensible que le précédent car il ne peut être utilisé directement su r
l'eau en raison de la trop grande dilution des substances toxiques. Il peut être amélioré par concentration de celle-ci, sur cartouches Sep-Pak Floris il
(Mill ipore) par exemple dans le cas de C. cf. nagasakiense, suivie d' une élution par solvants appropriés. C'est un test rapide car les résultats peuvent
être appréciés après 5 minutes d' incubation, mais
il nécessite la préparation de l'échantillon ;
- le test sur hématies de cheval se montre le plus
performant car il est à la fois relati vement rapide
(2 heures environ), et sensible par rapport au
Microtox. Il présente l'avantage d'être applicable
directement sur l'eau de mer diluée à 0,9 % de
salinité, et nécessite un appareillage simple.
Le test hémolytique est donc applicable à la
détection de substances au x propriétés cytolytiques présentes dans l'eau, susceptibles de nuire
aux organismes aquatiques en raison de ces propriétés. De nombreuses substances ont la propriété de lyser les membranes cellulaires ou d'en
modifier la perméabilité, et leur mode d'action est
différent selon leur nature ; cela ne permet pas
d'utiliser l' additivité de leurs effets. La méthode
est donc considérée comme une technique indicatrice de la présence de substances hémolytiques, même à faible concentration. Ell e ne
devient quantitative que lorsque la nature de la
substance recherchée est la même que celle du
standard utilisé comme référence.
Détection de la maïtotoxine
La maïtotoxine (MTX) est la toxine principale produite par un dinoflagellé benthique vivant dans les
eaux tropicales : Cambierdiscus toxicus. Sa structure a été récemment décrite par Murata et al.,
1993. Parmi les phycotoxines connues, c'est la
substance la plus puissante, elle provoque, entre
autres effets, une augmentation de la conce !ration intracellulaire en calcium libre et en inositotriphosphate (IP3).
Elle induit rapidement des perturbations du cytosquelette et de la forme cellu la ire(« macrobl ebb-