Test au rouge neutre
Cette méthode est basée sur la faculté du rouge
neutre (RN) à s'accumuler dans les lysosomes des
cellules vivantes. On détermine ainsi la viabilité
cellulaire sachant qu' il existe une relation linéaire
entre le nombre de cellules vi ables et la quantité
de rouge neutre incorporée dans les lysosomes.
Les cellules utilisées appartiennent à la lignée de
fibroblastes de rein de jeune hamster (BHK
21 / C13), maintenue en culture au laboratoire
d' après un protocole décrit par Diogène et ses
collaborateurs en 1994.
Le test se réalise dans des plaques 96 puits où les
cellules sont incubées 3 ou 24 heures à différentes
concentrations d' AO ou d' extrait. Après cette
incubation, les cellules sont exposées au rouge
neutre pendant 3 heures, délai au bout duquel la
densité optique est lue par un lecteur de plaques.
Les résultats sont exprimés en pourcentage d' absorption par rapport à un témoin. Ainsi d'après la
courbe sigmoïde, doses-effet, les concentrations
inhibitrices 20 %, 50 %, 80 % sont respectivement 13, 22 et 36 nM pour l' AO. Toutefois, la
CISO % de I'AO après 24 heures d'exposition est
moins élevée: 15 nM (Diogène et al., 1995).
À ce stade, le test permet une détermination semiquantitative mais n'est pas spécifique. On peut
cependant avoir une information sur le type de
toxine testée en analysant les altérations morphologiques durant la période d' incubation avec les
solutions toxiques. L' action de l' AO se caractérise
par un changement du contour initial des cellu les
en une forme polygonale avec « microblebbings »
(sorte de perles externes à la cellule), puis en une
forme arrondie. Cet effet s'explique, comme pour
le test précédent, par l' action spécifique de I'AO
sur certaines phosphatases.
A insi, ce test fournit deux types d' information
complémenta ires et peut être très utile lors d' un
« screening » pour mettre en évidence la toxicité
d' un extrait naturel inconnu.
Microtox
Le test Microtox™ est un test rapide, utilisé pour
évaluer la toxicité aiguë d' eaux de provenance
diverses : lixiviats, effluents ...
Tests biologiques
Il utilise des bactéries luminescentes : Photobacterium phosphoreum sur lesquelles on observe
l'effet de la ou des substance(s) à étudier en mesurant la luminescence émise. Toutes les voies métaboliques conduisant à la luminescence ne sont
pas connues, toutefois les résultats obtenus avec
ce test pour divers composés chimiques ont montré qu' il y a une corrélation avec ceux fournis par
les tests utilisant d' autres modèles :daphnies,
poissons, souris. Il est d'ailleurs souvent mis en
parallèle avec les essais sur poissons et daphnies
en raison du taux élevé de concordance qui
dépasse les 70 % . Sa mise en œuvre est très rapide puisqu' il faut 30 minutes entre la préparation
des différents réactifs et la lecture des résultats.
Il était donc intéressant de l' éprouver avec les
princ ipales phycotoxines : AO, brévétoxine,
ciguatoxine et saxitoxine.
Pour I' AO, comme pour les autres phycotoxines,
les résultats furent décevants. Alors qu'elles agissent d' une manière très spécifique sur les cellules
animales, elles n'ont aucun effet sur la cible bactérienne qu'est Phosphobacterium phosphoreum
aux fortes concentrations testées : 3 j.lg/ml pour la
saxitoxine et 23 j.lg/ml pour la brévétoxine.
Détection des hémolysines
Le test hémolytique est utilisé dans le but de
mettre en évidence la propriété qu'ont certaines
substances de lyser les membranes cellulaires.
Nous avons développé cette technique (Arzul et
al., 1993) sur des hématies de mouton (fournies
par Diagnostic Pasteur), pour la détection de la
saponine (Sigma), molécule dont la structure s'apparente à celle des hémolysine 1 et Il identifiées
par Yasumoto dans Cyrodinium aureolum = Cymnodinium cf. nagasakiense (Yasumoto et al. ,
1990).
Il en résulte une méthode de détection qualitative
rap ide (2 heures) et facile à mettre en œuvre
applicab le sur de faibles doses de molécule~
actives présentes dans l'eau de mer, par le biais
des ajouts internes. Cette méthode, basée sur la
cou rbe sigmoïde qui traduit le phénomène,
consiste à ajouter dans l'échantillon à tester une
113
Cette méthode est basée sur la faculté du rouge
neutre (RN) à s'accumuler dans les lysosomes des
cellules vivantes. On détermine ainsi la viabilité
cellulaire sachant qu' il existe une relation linéaire
entre le nombre de cellules vi ables et la quantité
de rouge neutre incorporée dans les lysosomes.
Les cellules utilisées appartiennent à la lignée de
fibroblastes de rein de jeune hamster (BHK
21 / C13), maintenue en culture au laboratoire
d' après un protocole décrit par Diogène et ses
collaborateurs en 1994.
Le test se réalise dans des plaques 96 puits où les
cellules sont incubées 3 ou 24 heures à différentes
concentrations d' AO ou d' extrait. Après cette
incubation, les cellules sont exposées au rouge
neutre pendant 3 heures, délai au bout duquel la
densité optique est lue par un lecteur de plaques.
Les résultats sont exprimés en pourcentage d' absorption par rapport à un témoin. Ainsi d'après la
courbe sigmoïde, doses-effet, les concentrations
inhibitrices 20 %, 50 %, 80 % sont respectivement 13, 22 et 36 nM pour l' AO. Toutefois, la
CISO % de I'AO après 24 heures d'exposition est
moins élevée: 15 nM (Diogène et al., 1995).
À ce stade, le test permet une détermination semiquantitative mais n'est pas spécifique. On peut
cependant avoir une information sur le type de
toxine testée en analysant les altérations morphologiques durant la période d' incubation avec les
solutions toxiques. L' action de l' AO se caractérise
par un changement du contour initial des cellu les
en une forme polygonale avec « microblebbings »
(sorte de perles externes à la cellule), puis en une
forme arrondie. Cet effet s'explique, comme pour
le test précédent, par l' action spécifique de I'AO
sur certaines phosphatases.
A insi, ce test fournit deux types d' information
complémenta ires et peut être très utile lors d' un
« screening » pour mettre en évidence la toxicité
d' un extrait naturel inconnu.
Microtox
Le test Microtox™ est un test rapide, utilisé pour
évaluer la toxicité aiguë d' eaux de provenance
diverses : lixiviats, effluents ...
Tests biologiques
Il utilise des bactéries luminescentes : Photobacterium phosphoreum sur lesquelles on observe
l'effet de la ou des substance(s) à étudier en mesurant la luminescence émise. Toutes les voies métaboliques conduisant à la luminescence ne sont
pas connues, toutefois les résultats obtenus avec
ce test pour divers composés chimiques ont montré qu' il y a une corrélation avec ceux fournis par
les tests utilisant d' autres modèles :daphnies,
poissons, souris. Il est d'ailleurs souvent mis en
parallèle avec les essais sur poissons et daphnies
en raison du taux élevé de concordance qui
dépasse les 70 % . Sa mise en œuvre est très rapide puisqu' il faut 30 minutes entre la préparation
des différents réactifs et la lecture des résultats.
Il était donc intéressant de l' éprouver avec les
princ ipales phycotoxines : AO, brévétoxine,
ciguatoxine et saxitoxine.
Pour I' AO, comme pour les autres phycotoxines,
les résultats furent décevants. Alors qu'elles agissent d' une manière très spécifique sur les cellules
animales, elles n'ont aucun effet sur la cible bactérienne qu'est Phosphobacterium phosphoreum
aux fortes concentrations testées : 3 j.lg/ml pour la
saxitoxine et 23 j.lg/ml pour la brévétoxine.
Détection des hémolysines
Le test hémolytique est utilisé dans le but de
mettre en évidence la propriété qu'ont certaines
substances de lyser les membranes cellulaires.
Nous avons développé cette technique (Arzul et
al., 1993) sur des hématies de mouton (fournies
par Diagnostic Pasteur), pour la détection de la
saponine (Sigma), molécule dont la structure s'apparente à celle des hémolysine 1 et Il identifiées
par Yasumoto dans Cyrodinium aureolum = Cymnodinium cf. nagasakiense (Yasumoto et al. ,
1990).
Il en résulte une méthode de détection qualitative
rap ide (2 heures) et facile à mettre en œuvre
applicab le sur de faibles doses de molécule~
actives présentes dans l'eau de mer, par le biais
des ajouts internes. Cette méthode, basée sur la
cou rbe sigmoïde qui traduit le phénomène,
consiste à ajouter dans l'échantillon à tester une
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