MATERIEL ET METHODES
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physiologique stérile et ensemencée sur boite de sélection, ce qui permet de sélectionner les
souches réceptrices ayant acquis le (s) caractère (s) transférable (s) de résistance aux
antibiotiques (Bakour et al., 1983 ; Courvalin et al., 1985). Ces dernières sont testées par
antibiogramme pour déterminer leur profil d’antibiorésistance.
Les boites de sélection sont préparées par l’ajout à la gélose Mueller-Hinton (en surfusion à
55°C) du Céfotaxime avec une concentration finale de 4μg/ml et de la Rifampicine
(250μg/ml) ou de l’Acide Nalidixique (50μg/ml).
IV.9. Recherche de gènes de résistance par PCR
La PCR est une technique basée sur l’amplification itérative d’un fragment d’ADN défini
par l’hybridation spécifique d’amorces. Les réactions PCR sont réalisées dans un volume de
12,5 μl ; les concentrations finales utilisées sont : PCR master Mix 2X (Tampon PCR 2X,
MgCl 2 , dNTPs) : 6.25 μl, Amorce sens et reverse : 0.25 μl chacune, ADN : 2.5 μl et eau : 3.25
μl.
L’ADN utilisé pour les réactions PCR a été extrait par chauffage à 100°C pendant 10 min. 3 à
4 colonies bactériennes sur gélose Mueller-Hinton supplémentée de 4μg/ml de céfotaxime
sont mises en suspension dans 50 μl d’eau distillée stérile. Après chauffage, l’inoculum
bactérien a subi une centrifugation à 12000 rpm pendant 2 min dans le but d’éliminer les
débris cellulaires.
Les gènes de béta-lactamases bla TEM et bla CTX-M ont été recherchés dans ces conditions : 1
cycle de dénaturation de 5 min à 94°C, 30 cycles de 94°C/40sec, 55°C/30sec, et 72°C/40sec
et une élongation finale de 10 min à 72°C (Kim et al, 2004). Les séquences des amorces
utilisées est donnée dans le tableau V.
Tableau V : Les séquences des amorces des gènes recherchés par PCR.
Gènes
Amorces (5’- 3’)
Taille du
fragment
Température
d’hybridation
Références
bla TEM
Up : ATGAGTATTCAACATTTCCG
Low : CCAATGCTTAATCAGTGAGG
858pb
55°C
Yates et al., 2003
bla CTX-M Up : GGTTAAAAAATCACTGCGTC
Low : TTGGTGACGATTTTAGCCGC
550pb
55°C
Kim et al., 2004
bla CTX-M-1 Up : GGTTAAAAAATCACTGCGTC
Low : TTGGTGACGATTTTAGCCGC
863pb
55°C
Kim et al., 2004
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physiologique stérile et ensemencée sur boite de sélection, ce qui permet de sélectionner les
souches réceptrices ayant acquis le (s) caractère (s) transférable (s) de résistance aux
antibiotiques (Bakour et al., 1983 ; Courvalin et al., 1985). Ces dernières sont testées par
antibiogramme pour déterminer leur profil d’antibiorésistance.
Les boites de sélection sont préparées par l’ajout à la gélose Mueller-Hinton (en surfusion à
55°C) du Céfotaxime avec une concentration finale de 4μg/ml et de la Rifampicine
(250μg/ml) ou de l’Acide Nalidixique (50μg/ml).
IV.9. Recherche de gènes de résistance par PCR
La PCR est une technique basée sur l’amplification itérative d’un fragment d’ADN défini
par l’hybridation spécifique d’amorces. Les réactions PCR sont réalisées dans un volume de
12,5 μl ; les concentrations finales utilisées sont : PCR master Mix 2X (Tampon PCR 2X,
MgCl 2 , dNTPs) : 6.25 μl, Amorce sens et reverse : 0.25 μl chacune, ADN : 2.5 μl et eau : 3.25
μl.
L’ADN utilisé pour les réactions PCR a été extrait par chauffage à 100°C pendant 10 min. 3 à
4 colonies bactériennes sur gélose Mueller-Hinton supplémentée de 4μg/ml de céfotaxime
sont mises en suspension dans 50 μl d’eau distillée stérile. Après chauffage, l’inoculum
bactérien a subi une centrifugation à 12000 rpm pendant 2 min dans le but d’éliminer les
débris cellulaires.
Les gènes de béta-lactamases bla TEM et bla CTX-M ont été recherchés dans ces conditions : 1
cycle de dénaturation de 5 min à 94°C, 30 cycles de 94°C/40sec, 55°C/30sec, et 72°C/40sec
et une élongation finale de 10 min à 72°C (Kim et al, 2004). Les séquences des amorces
utilisées est donnée dans le tableau V.
Tableau V : Les séquences des amorces des gènes recherchés par PCR.
Gènes
Amorces (5’- 3’)
Taille du
fragment
Température
d’hybridation
Références
bla TEM
Up : ATGAGTATTCAACATTTCCG
Low : CCAATGCTTAATCAGTGAGG
858pb
55°C
Yates et al., 2003
bla CTX-M Up : GGTTAAAAAATCACTGCGTC
Low : TTGGTGACGATTTTAGCCGC
550pb
55°C
Kim et al., 2004
bla CTX-M-1 Up : GGTTAAAAAATCACTGCGTC
Low : TTGGTGACGATTTTAGCCGC
863pb
55°C
Kim et al., 2004