MATERIEL ET METHODES
30
IV.10. Electrophorèse sur gel d’agarose
C’est une méthode standardisée qui assure la séparation, l’identification et la purification des
fragments d’ADN chargé négativement. La migration de l’ADN dans le gel d’agarose, soumis
à un champ électrique, dépend des paramètres suivants : le poids moléculaire, la concentration
d’agarose dans le gel, la conformation de l’ADN, le voltage appliqué et la composition du
tampon d’électrophorèse (Sambrook et al., 1989).
Dans le cas des produits d’amplification des PCR, un gel d’agarose à 1% a été préparé dans
un tampon TBE 1X additionné de bromure d’éthidium (0.5μg/ml). Les amplifiats additionnés
de la solution de dépôt à raison de 1μl pour 5μl d’ADN ont été mis à migrer dans un champ
électrique à un voltage de 5V/cm. Un marqueur de poids moléculaire 100pb DNA ladder
(Promega) a été utilisé pour déterminer la taille des d’amplifiats.
Solutions employées
Tampon TBE 10X (pH=8.3, autoclavé) : 890 mM de Tris Base, 890 mM d’acide borique,
et 19 mM d’EDTA.
Solution de dépôt (aliquotée et conservée à 4°C) : Glycérol 50%, EDTA-NA 2 100mM,
pH=8, et Bleu de bromophénol 0.2% ; SDS 3%.
IV.11. Extraction d’ADN plasmidique par lyse alcaline
L’ADN plasmidique des souches sauvages et des transconjugants a été extrait des cultures
en phase exponentielle par la méthode de Kado et Liu (1981). L’extraction de L’ADN
plasmidique est réalisée sur 3 ml de culture bactérienne dans du bouillon BHIB.
Le culot bactérien obtenu dans un microtube Eppendorf à 12000 rpm pendant 2 min est repris
dans 100 μl de Tampon TE (Tris 50 mM, EDTA 10mM) ; celui-ci permet de fragiliser la
paroi bactérienne et d’empêcher la dégradation de l’ADN par les nucléases via la présence de
chélateur d’ions. Cette suspension est mise en contact avec 200 μl de solution de lyse alcaline
(3% SDS dans du Tris 50 mM, pH : 12,6). Le mélange obtenu par inversion du microtube est
mis à chauffer à 60°C pendant 25 min. Un volume de 600 µl de phénol est ajouté à la
suspension bactérienne afin d’éliminer les contaminants majeurs de l’ADN plasmidique
(protéines, ADN chromosomique et ARN de haut poids moléculaire). Le surnageant aqueux
contenant l’ADN plasmidique prêt à être analysé est récupéré après 15 min de centrifugation
à 12000 rpm.
Après électrophorèse sur gel d’agarose à 0.7%, le gel est mis dans une solution de bromure
d’éthidium à 0.5μg/ml pendant 40 min et l’ADN plasmidique est visualisé sous UV
(Sambrook et al., 1989). La taille des plasmides est estimée par comparaison avec des
plasmides standards pRK2013 (54 kb), pIP113 (48 kb) et pBR322 (4.36 kb) et de la souche
d’E. coli V517 (54, 35, 5.6, 5.1, 3.9, 3, 2.7 et 2.1 kb).
30
IV.10. Electrophorèse sur gel d’agarose
C’est une méthode standardisée qui assure la séparation, l’identification et la purification des
fragments d’ADN chargé négativement. La migration de l’ADN dans le gel d’agarose, soumis
à un champ électrique, dépend des paramètres suivants : le poids moléculaire, la concentration
d’agarose dans le gel, la conformation de l’ADN, le voltage appliqué et la composition du
tampon d’électrophorèse (Sambrook et al., 1989).
Dans le cas des produits d’amplification des PCR, un gel d’agarose à 1% a été préparé dans
un tampon TBE 1X additionné de bromure d’éthidium (0.5μg/ml). Les amplifiats additionnés
de la solution de dépôt à raison de 1μl pour 5μl d’ADN ont été mis à migrer dans un champ
électrique à un voltage de 5V/cm. Un marqueur de poids moléculaire 100pb DNA ladder
(Promega) a été utilisé pour déterminer la taille des d’amplifiats.
Solutions employées
Tampon TBE 10X (pH=8.3, autoclavé) : 890 mM de Tris Base, 890 mM d’acide borique,
et 19 mM d’EDTA.
Solution de dépôt (aliquotée et conservée à 4°C) : Glycérol 50%, EDTA-NA 2 100mM,
pH=8, et Bleu de bromophénol 0.2% ; SDS 3%.
IV.11. Extraction d’ADN plasmidique par lyse alcaline
L’ADN plasmidique des souches sauvages et des transconjugants a été extrait des cultures
en phase exponentielle par la méthode de Kado et Liu (1981). L’extraction de L’ADN
plasmidique est réalisée sur 3 ml de culture bactérienne dans du bouillon BHIB.
Le culot bactérien obtenu dans un microtube Eppendorf à 12000 rpm pendant 2 min est repris
dans 100 μl de Tampon TE (Tris 50 mM, EDTA 10mM) ; celui-ci permet de fragiliser la
paroi bactérienne et d’empêcher la dégradation de l’ADN par les nucléases via la présence de
chélateur d’ions. Cette suspension est mise en contact avec 200 μl de solution de lyse alcaline
(3% SDS dans du Tris 50 mM, pH : 12,6). Le mélange obtenu par inversion du microtube est
mis à chauffer à 60°C pendant 25 min. Un volume de 600 µl de phénol est ajouté à la
suspension bactérienne afin d’éliminer les contaminants majeurs de l’ADN plasmidique
(protéines, ADN chromosomique et ARN de haut poids moléculaire). Le surnageant aqueux
contenant l’ADN plasmidique prêt à être analysé est récupéré après 15 min de centrifugation
à 12000 rpm.
Après électrophorèse sur gel d’agarose à 0.7%, le gel est mis dans une solution de bromure
d’éthidium à 0.5μg/ml pendant 40 min et l’ADN plasmidique est visualisé sous UV
(Sambrook et al., 1989). La taille des plasmides est estimée par comparaison avec des
plasmides standards pRK2013 (54 kb), pIP113 (48 kb) et pBR322 (4.36 kb) et de la souche
d’E. coli V517 (54, 35, 5.6, 5.1, 3.9, 3, 2.7 et 2.1 kb).