MATERIEL ET METHODES
27
Mueller Hinton sur le nombre de bactéries de coliformes totaux et de la flore totale,
respectivement (Guardabassi et al., 2002).
IV.4. Isolement et identification bactérienne
Les souches ayant présentées une résistance aux antibiotiques IMP, CTX, FOX et CAZ ont
fait l’objet d’un réisolement sur Mueller Hinton supplémenté de l’antibiotique approprié, afin
de confirmer leur résistance. Les bactéries isolées et conservées ont été identifiées par galeries
API 20E (Bio Mérieux).
Ce système d’identification des entérobactéries et autres bacilles à Gram négatif comporte 20
tests biochimiques standardisés et miniaturisés. Les milieux déshydratés sont reconstitués
avec une suspension bactérienne préparée dans 5 ml d’eau physiologique (0.9% NaCl)
contenant 1 à 3 colonies pures de culture jeune (18h). Les réactions produites pendant la durée
d’incubation (24-48 h à 35±2°C) se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés
par l’addition de réactifs. La codification des réactions en un profil numérique permet, en se
référant à un catalogue analytique fourni par le fabriquant, de déterminer l’identité des
souches bactériennes.
Le test d’oxydase est réalisé à part en déposant quelques colonies de la bactérie à identifier
sur un disque contenant l’oxalate de dimethyl-paraphenylène-diamine qui est incolore.
L’apparition de coloration violette indique la présence d’oxydase.
IV.5. Etude de la sensibilité aux antibiotiques par antibiogramme
La sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques a été réalisée in vitro par la méthode de
diffusion en milieu gélosé (Courvalin et al., 1985 ; CA-SFM, 2008). Cette technique est
basée sur l’observation de la croissance bactérienne en présence d’un gradient de
concentration d’antibiotiques obtenu par diffusion à partir des disques d’antibiotiques dans un
milieu gélosé (Muller-Hinton). Ce gradient est inversement proportionnel à la distance par
rapport aux disques. La croissance s’arrête lorsque les bactéries sont en contact avec leur
concentration minimale d’inhibition dessinant ainsi des halos d’inhibition autour du disque
d’antibiotique.
Technique
A partir d’une culture de 18-24 h sur milieu gélosé non sélectif (Mueller Hinton), une
suspension bactérienne équivalente à 10
8 cellule/ml (DO=0.08-0.10 à 625nm) a été préparée
dans de l’eau physiologique stérile. La suspension inoculum est diluée au 1/10 puis utilisée
pour l’ensemencement par écouvillonnage de la surface d’une gélose Mueller-Hinton
préalablement séchée. Les disques d’antibiotiques à tester sont déposés à l’aide d’un
distributeur stérile suivant la disposition de Vedel (1997) pour les béta-lactamines (Fig.9).
Après incubation pendant 18-24 h à 35±2°C, la lecture des boites de culture est faite en
mesurant avec précision les diamètres d’inhibition à l’aide d’une règle.
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Mueller Hinton sur le nombre de bactéries de coliformes totaux et de la flore totale,
respectivement (Guardabassi et al., 2002).
IV.4. Isolement et identification bactérienne
Les souches ayant présentées une résistance aux antibiotiques IMP, CTX, FOX et CAZ ont
fait l’objet d’un réisolement sur Mueller Hinton supplémenté de l’antibiotique approprié, afin
de confirmer leur résistance. Les bactéries isolées et conservées ont été identifiées par galeries
API 20E (Bio Mérieux).
Ce système d’identification des entérobactéries et autres bacilles à Gram négatif comporte 20
tests biochimiques standardisés et miniaturisés. Les milieux déshydratés sont reconstitués
avec une suspension bactérienne préparée dans 5 ml d’eau physiologique (0.9% NaCl)
contenant 1 à 3 colonies pures de culture jeune (18h). Les réactions produites pendant la durée
d’incubation (24-48 h à 35±2°C) se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés
par l’addition de réactifs. La codification des réactions en un profil numérique permet, en se
référant à un catalogue analytique fourni par le fabriquant, de déterminer l’identité des
souches bactériennes.
Le test d’oxydase est réalisé à part en déposant quelques colonies de la bactérie à identifier
sur un disque contenant l’oxalate de dimethyl-paraphenylène-diamine qui est incolore.
L’apparition de coloration violette indique la présence d’oxydase.
IV.5. Etude de la sensibilité aux antibiotiques par antibiogramme
La sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques a été réalisée in vitro par la méthode de
diffusion en milieu gélosé (Courvalin et al., 1985 ; CA-SFM, 2008). Cette technique est
basée sur l’observation de la croissance bactérienne en présence d’un gradient de
concentration d’antibiotiques obtenu par diffusion à partir des disques d’antibiotiques dans un
milieu gélosé (Muller-Hinton). Ce gradient est inversement proportionnel à la distance par
rapport aux disques. La croissance s’arrête lorsque les bactéries sont en contact avec leur
concentration minimale d’inhibition dessinant ainsi des halos d’inhibition autour du disque
d’antibiotique.
Technique
A partir d’une culture de 18-24 h sur milieu gélosé non sélectif (Mueller Hinton), une
suspension bactérienne équivalente à 10
8 cellule/ml (DO=0.08-0.10 à 625nm) a été préparée
dans de l’eau physiologique stérile. La suspension inoculum est diluée au 1/10 puis utilisée
pour l’ensemencement par écouvillonnage de la surface d’une gélose Mueller-Hinton
préalablement séchée. Les disques d’antibiotiques à tester sont déposés à l’aide d’un
distributeur stérile suivant la disposition de Vedel (1997) pour les béta-lactamines (Fig.9).
Après incubation pendant 18-24 h à 35±2°C, la lecture des boites de culture est faite en
mesurant avec précision les diamètres d’inhibition à l’aide d’une règle.