Chapitre 3
Matériel et Méthodes
42
VI.
Dosage de la chlorophylle-a par la Spectrofluorimétrie ultraviolet (S.F.U.V)
En milieu marin, comme en eau douce, la mesure de la chlorophylle-a permet de caractériser
la biomasse (quantité de matière vivante) phytoplanctonique. C’est un descripteur de la
capacité de production d’un végétal. D’une manière générale, la mesure des pigments
phytoplanctoniques est basée sur leurs propriétés optiques : absorption de la lumière
(spectrométrie) ou fluorescence (Fluorimétrie). La Fluorimétrie est plus sensible que la
spectrométrie d’au moins d’un ordre de grandeur. Elle est donc souvent utilisée en zone
oligotrophe et dans les situations ou l’on ne dispose que de petits échantillons. La
chlorophylle a est un constituant intracellulaire, sa mesure nécessite la récupération des
cellules en suspension dans le milieu par filtration. Le matériel cellulaire récolté sur le filtre
subi une extraction par solvant. La mesure de l’extrait peut se faire de manière non séparative
ou par séparation chromatographique (HPLC).
Les pigments chlorophylliens sont très sensibles à la lumière et au pH. En milieu acide, la
dégradation de la chlorophylle produit de la phéophytine-a (Rodier, 2005).
Dans notre cas, nous avons adopté la méthode fluorimétrique de Yenstch Menzel (1963)
adapté par Holm- Hansen et Reimann (1978) pour l’extraction des pigments à l’aide du
méthanol. C’est une technique d'analyse de la chlorophylle appliquée par Levy (1977) et
préconisée par le C.I.O de l'U.N.E.S.C.O (1977), (Marchand, 1983 et Roussel, 1983, in
Bentebbal et Tichouiti, 1999) et elle a été décrite par Raimbault et al. (1988), (in Raimbault et
al. 1992).
VI.1. Principe
La SFUV mesure l’émission de fluorescence de molécules soumises à un rayonnement
d’excitation ultraviolet. La réponse est fonction de la structure moléculaire et s’applique aux
molécules possédant des liaisons doubles conjuguées.
VI.2. Appareillage
Dispositif de filtration : la filtration est effectuée sous vide léger en utilisant des filtres en
fibre verre (GF/F, 0,45 μm).
Tubes de mesure : pour l’extraction, des tubes en verre avec bouchon.
Centrifugeuse : Centrifugeuse Hettich ZENTRIFUGEN de type EBA 30.
Spectrophotomètre fluorescence : de type HITACHI, modèle 650 S, équipé d’une lampe «
Xénon » qui est la source du rayonnement UV et des cellules en quartz de 1 cm de trajet
optique.
VI.3. Réactifs
Suspension carbonate de magnésium MgCO3 à 1 % ;
Solvant d'extraction : Méthanol pur pour analyse à 99,7 % ;
Matériel et Méthodes
42
VI.
Dosage de la chlorophylle-a par la Spectrofluorimétrie ultraviolet (S.F.U.V)
En milieu marin, comme en eau douce, la mesure de la chlorophylle-a permet de caractériser
la biomasse (quantité de matière vivante) phytoplanctonique. C’est un descripteur de la
capacité de production d’un végétal. D’une manière générale, la mesure des pigments
phytoplanctoniques est basée sur leurs propriétés optiques : absorption de la lumière
(spectrométrie) ou fluorescence (Fluorimétrie). La Fluorimétrie est plus sensible que la
spectrométrie d’au moins d’un ordre de grandeur. Elle est donc souvent utilisée en zone
oligotrophe et dans les situations ou l’on ne dispose que de petits échantillons. La
chlorophylle a est un constituant intracellulaire, sa mesure nécessite la récupération des
cellules en suspension dans le milieu par filtration. Le matériel cellulaire récolté sur le filtre
subi une extraction par solvant. La mesure de l’extrait peut se faire de manière non séparative
ou par séparation chromatographique (HPLC).
Les pigments chlorophylliens sont très sensibles à la lumière et au pH. En milieu acide, la
dégradation de la chlorophylle produit de la phéophytine-a (Rodier, 2005).
Dans notre cas, nous avons adopté la méthode fluorimétrique de Yenstch Menzel (1963)
adapté par Holm- Hansen et Reimann (1978) pour l’extraction des pigments à l’aide du
méthanol. C’est une technique d'analyse de la chlorophylle appliquée par Levy (1977) et
préconisée par le C.I.O de l'U.N.E.S.C.O (1977), (Marchand, 1983 et Roussel, 1983, in
Bentebbal et Tichouiti, 1999) et elle a été décrite par Raimbault et al. (1988), (in Raimbault et
al. 1992).
VI.1. Principe
La SFUV mesure l’émission de fluorescence de molécules soumises à un rayonnement
d’excitation ultraviolet. La réponse est fonction de la structure moléculaire et s’applique aux
molécules possédant des liaisons doubles conjuguées.
VI.2. Appareillage
Dispositif de filtration : la filtration est effectuée sous vide léger en utilisant des filtres en
fibre verre (GF/F, 0,45 μm).
Tubes de mesure : pour l’extraction, des tubes en verre avec bouchon.
Centrifugeuse : Centrifugeuse Hettich ZENTRIFUGEN de type EBA 30.
Spectrophotomètre fluorescence : de type HITACHI, modèle 650 S, équipé d’une lampe «
Xénon » qui est la source du rayonnement UV et des cellules en quartz de 1 cm de trajet
optique.
VI.3. Réactifs
Suspension carbonate de magnésium MgCO3 à 1 % ;
Solvant d'extraction : Méthanol pur pour analyse à 99,7 % ;