Chapitre 3
Matériel et Méthodes
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VI.4. Mode opératoire
 Après avoir filtré un volume de 230 ml d’échantillon, nous avons ajouté quelques
gouttes de MgCO3 sur le filtre afin de le conserver ;
 Le filtre est plié en quatre et enrobé dans du papier aluminium qui est étiqueté au
préalable. Ensuite les filtres sont conservés dans un congélateur pour une analyse
ultérieure ;
 Après avoir décongelé le filtre, ce dernier est mis dans un tube après son
conditionnement avec du méthanol ;
 Ajouter 7 ml de méthanol à 99,7 % dans le tube contenant le filtre ;
 Le tube est ensuite bouché et placé à l’obscurité dans un réfrigérateur (5 °C), pour une
période d'extraction de 30 minutes.
 Après l’extraction, vient la centrifugation à 3000 tours/min, pendant 2 minutes ;
 Allumer l'appareil et la lampe une heure avant les mesures ;
 Régler le zéro de l'appareil avec un tube témoin contenant un filtre vierge ayant subi
les mêmes traitements que les échantillons, excepté la filtration du plancton ;
 Après ce délai la fluorescence de l'échantillon est mesurée sur le spectrophotomètre
fluorescence dans la cellule en quartz.
VI.5. Etalonnage
L’étalonnage est réalisé à l’aide d’une série de cinq standards, et un blanc du méthanol pour
tracer une droite d’étalonnage de la chlorophylle-a.
Ces standards sont préparés à partir d’une solution mère de chlorophylle-a de concentration 4
mg/l, la solution est obtenue par dissolution de 1 mg de chlorophylle-a pure dans 250 ml de
méthanol.
VI.6. Mesure de l’intensité de fluorescence
Les conditions opératoires pour la mesure de l’intensité de fluorescence des pigments présents
dans la chlorophylle, établies par les experts de la C.O.I (1982), stipulent que la lecture de
cette intensité doit se faire dans les longueurs d’ondes suivantes :
Longueur d’onde d’excitation : 450 nm ;
Longueur d’onde d’émission : 670 nm ;
Les fentes d’excitation et d’émission sont respectivement fixées à 2 nm et 20 nm.
La méthode apporte une correction pour la présence de phéopigments-a, laquelle absorbe à
une longueur d’onde voisine de la chlorophylle a. La mesure fluorométrique est effectuée
avant acidification et après une acidification qui transforme toute la chlorophylle-a en
phéopigments a laquelle émet de la fluorescence avec moins d’intensité. Cette opération
permet de corriger l’interférence des phéopigments a sur la chlorophylle a et, du même coup,
de doser la phéopigment-a.
Nous avons mesuré l’intensité de fluorescence IF0, puis ajouter 10 μl d'HCl dans la cellule,
attendre 1 minute puis lire l’intensité de fluorescence IFa.
Le tableau suivant donne les concentrations des standards et leurs intensités de fluorescence
(IF0) ainsi que l’intensité IFa après acidification, mesurées en unité arbitraire (U.A.) :