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La recherche du meilleur alignement. est obtenu par le programme ‘Sequencing Analysis’ pour
ordinateur Mac Intosh, adapté a l’ABI Prism 310
BDT
. Cette étape nécessite une analyse pas à pas des
différentes séquences, afin d’identifier les insertions, les mutations ou les délétions (fig. 12). Il faut
ensuite reprendre les alignements obtenus par la machine et vérifier les différentes séquences afin
de corriger les erreurs d’impression ou les éventuelles omissions ; ceci étant la partie la plus ardue
du protocole expérimental.
Un bon alignement est essentiel pour l’étape suivante, la construction des arbres phylogénétiques.
L’alignement influence les distances génétiques entre deux espèces. On trouvera un certain nombre
de logiciels sur le réseau Internet ; dont le programme MEGA (Kumar et al, 2001) qui permet la
mise en forme et l’analyse des données brutes importées du Mac Intosh sur PC.
2.2.3. Analyse du polymorphisme des séquences
Un fragment de nageoire caudale (environ 1cm
2
) a été prélevé pour chaque raie et stocké à basse
température (4°C). Les raies ont été échantillonnées de décembre 2002 à juin 2003 à la poissonnerie
d’Alger.
L’analyse génético-moléculaire a été réalisée entièrement au ‘Laboratory Interdept. Center for
Research in Environmental Sciences, Molecular Genetics for Environmental & Fishery Resources’
(Université de Bologne, Italie).
Les marqueurs utilisés sont les séquences nucléotidiques de la région à grande variabilité des gènes
mitochondriaux 16S ADNr et D-Loop (ou CR). Des amorces ou ‘primers’ ont servi pour
l’amplification et le séquençage spécifique (tab. 2):
Tableau 2 - Amorces utilisées pour l’amplification et le séquençage de l’ADN (gènes CR et 16S)
Gène
Amorce
Séquence
Référence
16S 16S Vforward (ou direct) 5’TACATAACAGGAGAAGAC3’
Parker et Kornfield,
1996
16S 16S Vreverse (ou inverse) 5’GTGATTGCGCTGTTATTC3’
Parker et Kornfield,
1996
CR ElDloopF
5’TCCCAAAGCCAAGATTCTGC3’
Valsecchi et al, 2005
CR RajinaeP7R
5’AAACTGGGAGGGCTGGAAATCTTGA3’ Valsecchi et al, 2005
Les primers ont fourni des régions comportant environ 240 pb pour le gène 16 S et
approximativement 588 pb pour le gène D-loop.
La PCR a été réalisée dans des solutions de 25 µl contenant 2ng d’ADNg, 1 X Promega Taq buffer
A, 2mM MgCl2, 0.2 mM de chaque dNTP (BRL), 0.5µl de chaque amorce et 0.1 µl de Taq
(Promega).
La recherche du meilleur alignement. est obtenu par le programme ‘Sequencing Analysis’ pour
ordinateur Mac Intosh, adapté a l’ABI Prism 310
BDT
. Cette étape nécessite une analyse pas à pas des
différentes séquences, afin d’identifier les insertions, les mutations ou les délétions (fig. 12). Il faut
ensuite reprendre les alignements obtenus par la machine et vérifier les différentes séquences afin
de corriger les erreurs d’impression ou les éventuelles omissions ; ceci étant la partie la plus ardue
du protocole expérimental.
Un bon alignement est essentiel pour l’étape suivante, la construction des arbres phylogénétiques.
L’alignement influence les distances génétiques entre deux espèces. On trouvera un certain nombre
de logiciels sur le réseau Internet ; dont le programme MEGA (Kumar et al, 2001) qui permet la
mise en forme et l’analyse des données brutes importées du Mac Intosh sur PC.
2.2.3. Analyse du polymorphisme des séquences
Un fragment de nageoire caudale (environ 1cm
2
) a été prélevé pour chaque raie et stocké à basse
température (4°C). Les raies ont été échantillonnées de décembre 2002 à juin 2003 à la poissonnerie
d’Alger.
L’analyse génético-moléculaire a été réalisée entièrement au ‘Laboratory Interdept. Center for
Research in Environmental Sciences, Molecular Genetics for Environmental & Fishery Resources’
(Université de Bologne, Italie).
Les marqueurs utilisés sont les séquences nucléotidiques de la région à grande variabilité des gènes
mitochondriaux 16S ADNr et D-Loop (ou CR). Des amorces ou ‘primers’ ont servi pour
l’amplification et le séquençage spécifique (tab. 2):
Tableau 2 - Amorces utilisées pour l’amplification et le séquençage de l’ADN (gènes CR et 16S)
Gène
Amorce
Séquence
Référence
16S 16S Vforward (ou direct) 5’TACATAACAGGAGAAGAC3’
Parker et Kornfield,
1996
16S 16S Vreverse (ou inverse) 5’GTGATTGCGCTGTTATTC3’
Parker et Kornfield,
1996
CR ElDloopF
5’TCCCAAAGCCAAGATTCTGC3’
Valsecchi et al, 2005
CR RajinaeP7R
5’AAACTGGGAGGGCTGGAAATCTTGA3’ Valsecchi et al, 2005
Les primers ont fourni des régions comportant environ 240 pb pour le gène 16 S et
approximativement 588 pb pour le gène D-loop.
La PCR a été réalisée dans des solutions de 25 µl contenant 2ng d’ADNg, 1 X Promega Taq buffer
A, 2mM MgCl2, 0.2 mM de chaque dNTP (BRL), 0.5µl de chaque amorce et 0.1 µl de Taq
(Promega).