MATERIELS ET METHODES
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Technique
Préparer l’inoculum bactérien : 3 à 4 colonies dans 50µl d’eau distillée stérile.
Mettre l’inoculum à 100°C pendant 10mn pour la lyse.
Centrifuger à 12000trs/min pendant 2mn.
Récupérer le surnageant.
Mettre dans des microtubes 2.5µl du lysat (le surnageant) + 10µl du Mix.
Mettre dans l’appareil à PCR pour l’amplification en appliquant le programme
correspondant.
PCR Master Mix (promega) pour un volume de réaction de 12,5µl :
PCR master Mix (2X)……………………………..6,25µL
Amorce sens……………………………………….25µM
Amorce antisens…………………………………...25µM
H 2 O………………………………………………..3,25µl
ADN……………………………………………….2,5µl
Deux gènes de béta-lactamases (TEM et CTX-M) ont été recherchés par le programme
suivant (Kim et al, 2004): 94°C pendant 10min, 30 cycles de 94°C pendant 40sec, 55°C
pendant 30sec, et 72°C pendant 40sec et une élongation finale de 10min à 72°C.
La taille des produits d’amplification (tableau 3) a été déterminée en utilisant un
marqueur de taille : 100pb DNA ladder (Proméga).
Tableau III : Les séquences des amorces des gènes recherchés par PCR (Kim et al, 2004)
Gène
Amorces
Taille du
fragment
Température
d’hybridation
TEM
Up : ATGAGTATTCAACATTTCCG
Low : CCAATGCTTAATCAGTGAGG
858pb
55
CTX-M
Up : GGTTAAAAAATCACTGCGTC
Low : TTGGTGACGATTTTAGCCGC
550pb
55