MATERIELS ET METHODES
29
Racler la culture mixte et la mettre en suspension dans 5ml d’eau physiologique
stérile,
Ensemencer les boîtes de sélection par la suspension bactérienne contenue dans l’eau
physiologique ainsi que les souches parentales,
Après une incubation pendant 20h à 35°C, Vérifier les boites de sélection où seules les
transconjugants doivent pousser,
Les transconjugants obtenus seront analysés par antibiogramme.
Les boites de sélection ont été préparées de la sorte :
1ml de CTX (avec une concentration finale de 4µg/ml),
1ml de RA (avec une concentration finale de 250µg/ml) ou
acide nalidixique NA (concentration finale de 50µg/ml)
18ml de gélose M.H.
II.2.4.6. Recherche de gènes BLSE par PCR (Polymerase Chain Reaction)
Principe
La PCR est une technique basée sur l’hybridation spécifique des amorces avec le gène
recherché. Elle permet l’amplification du fragment cible balisé par ces deux amorces. Le
processus nécessite la succession d’un certain nombre de cycles (20-40), chaque cycle
comporte les étapes suivantes :
La dénaturation de l’ADN à 94°C,
L’amorçage : hybridation des amorces de part et d’autre du fragment à amplifier (4060°C),
L’élongation : la synthèse du brin d’ADN est réalisée par la taq polymérase à 72°C, en
respectant la complémentarité des bases,
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Racler la culture mixte et la mettre en suspension dans 5ml d’eau physiologique
stérile,
Ensemencer les boîtes de sélection par la suspension bactérienne contenue dans l’eau
physiologique ainsi que les souches parentales,
Après une incubation pendant 20h à 35°C, Vérifier les boites de sélection où seules les
transconjugants doivent pousser,
Les transconjugants obtenus seront analysés par antibiogramme.
Les boites de sélection ont été préparées de la sorte :
1ml de CTX (avec une concentration finale de 4µg/ml),
1ml de RA (avec une concentration finale de 250µg/ml) ou
acide nalidixique NA (concentration finale de 50µg/ml)
18ml de gélose M.H.
II.2.4.6. Recherche de gènes BLSE par PCR (Polymerase Chain Reaction)
Principe
La PCR est une technique basée sur l’hybridation spécifique des amorces avec le gène
recherché. Elle permet l’amplification du fragment cible balisé par ces deux amorces. Le
processus nécessite la succession d’un certain nombre de cycles (20-40), chaque cycle
comporte les étapes suivantes :
La dénaturation de l’ADN à 94°C,
L’amorçage : hybridation des amorces de part et d’autre du fragment à amplifier (4060°C),
L’élongation : la synthèse du brin d’ADN est réalisée par la taq polymérase à 72°C, en
respectant la complémentarité des bases,