Chapitre Ш
Matériel et méthodes
41
Ш.2.6.1.3. La recherche des Salmonelles et les Vibrions
La recherche des salmonelles et des vibrions est effectuée par la méthode qualitative,
réalisée en trois étapes successives : l’enrichissement, l’isolement et l’identification
biochimique.
a) Recherche des salmonelles
Pour l’enrichissement, On utilise le milieu de culture SFB (Bouillon au Sélénite de
Sodium et Cystéine). Le Gélose SS est utilisé pour isoler les colonies typiques des
salmonelles à partir des tubes d’enrichissement.
Des galeries d’identification biochimiques ainsi que quelques tests classiques ont été
utilisées pour confirmer l’espèce appartenant au genre Salmonella. (Figures 22 et 23).
b) Recherche des vibrions
Ce sont des germes pathogènes pour l’homme et les animaux, on utilise le milieu Eau
Peptonée Alcaline (EPA) 10 fois concentré pour l’enrichissement. L’isolement est réalisé sur
Gélose TCBS, les colonies présumées vibrions ont été identifiées (coloration de Gram, test de
la catalase, test de l’oxydase tests biochimiques à l’aide de la galerie API 20E) (Figure 24 et
25).
Ш.2.6.2. Recherche et numération des bactéries dans les sédiments (Figure 26)
Dans ce cas la technique utilisée est celle des tubes multiples basée sur l’ensemencement
de plusieurs séries de tubes contenant des milieux de culture liquides, puis la détermination du
nombre caractéristique (nombre de tubes positifs pour chaque dilution qui permettra
l'établissement du nombre le plus probable, par le calcul ou la consultation de la table de Mc
Grady (Rodier et al, 2005).
En effet, prendre 25g de sédiment à analyser et lui rajouter 225 ml d’eau physiologique
stérile dans un flacon stérile, bien homogénéiser le tout (dilution mère : 10
-1 ), prendre 1 ml à
l’aide d’une pipette graduée stérile de DM pour la mettre dans un tube de 09 ml d’eau
physiologique stérile (10
-2
), de même préparer d’autre dilutions : 10
-3 et 10
-4 .
Ш.2.6.2.1. Numération des coliformes totaux et des coliformes fécaux
Ce test est fait sur un milieu sélectif Bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVB), sa
fermentation se traduit par un dégagement de gaz dans la cloche de Durham et un trouble
après une incubation à 37°C pour les coliformes totaux et à 44°C pour les coliformes fécaux.
Ш.2.6.2.2. Numération des streptocoques fécaux
La numération des streptocoques fécaux s’effectue en deux étapes :
a) Test présomptif
Il est réalisé sur le milieu de Rothe (séries des trois tubes) :
- Ensemencer chaque série de tubes contenant 10 ml du milieu Rothe simple
concentré, par 1ml de chaque dilution. L’incubation se fait à 37°C pendant 48 h.
- Les tubes présentant un trouble accompagné d’un dépôt blanchâtre sont présumés
de contenir des streptocoques fécaux, ils seront soumis à un test confirmatif.
-
b) Test confirmatif
Chaque tube positif est ensemencé sur bouillon de Eva Litsky, l’incubation s’effectue
pendant 48 h à 37°C. Les tubes présentant un trouble accompagné d’un dépôt formant une
pastille violette, contiennent des streptocoques fécaux.
Matériel et méthodes
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Ш.2.6.1.3. La recherche des Salmonelles et les Vibrions
La recherche des salmonelles et des vibrions est effectuée par la méthode qualitative,
réalisée en trois étapes successives : l’enrichissement, l’isolement et l’identification
biochimique.
a) Recherche des salmonelles
Pour l’enrichissement, On utilise le milieu de culture SFB (Bouillon au Sélénite de
Sodium et Cystéine). Le Gélose SS est utilisé pour isoler les colonies typiques des
salmonelles à partir des tubes d’enrichissement.
Des galeries d’identification biochimiques ainsi que quelques tests classiques ont été
utilisées pour confirmer l’espèce appartenant au genre Salmonella. (Figures 22 et 23).
b) Recherche des vibrions
Ce sont des germes pathogènes pour l’homme et les animaux, on utilise le milieu Eau
Peptonée Alcaline (EPA) 10 fois concentré pour l’enrichissement. L’isolement est réalisé sur
Gélose TCBS, les colonies présumées vibrions ont été identifiées (coloration de Gram, test de
la catalase, test de l’oxydase tests biochimiques à l’aide de la galerie API 20E) (Figure 24 et
25).
Ш.2.6.2. Recherche et numération des bactéries dans les sédiments (Figure 26)
Dans ce cas la technique utilisée est celle des tubes multiples basée sur l’ensemencement
de plusieurs séries de tubes contenant des milieux de culture liquides, puis la détermination du
nombre caractéristique (nombre de tubes positifs pour chaque dilution qui permettra
l'établissement du nombre le plus probable, par le calcul ou la consultation de la table de Mc
Grady (Rodier et al, 2005).
En effet, prendre 25g de sédiment à analyser et lui rajouter 225 ml d’eau physiologique
stérile dans un flacon stérile, bien homogénéiser le tout (dilution mère : 10
-1 ), prendre 1 ml à
l’aide d’une pipette graduée stérile de DM pour la mettre dans un tube de 09 ml d’eau
physiologique stérile (10
-2
), de même préparer d’autre dilutions : 10
-3 et 10
-4 .
Ш.2.6.2.1. Numération des coliformes totaux et des coliformes fécaux
Ce test est fait sur un milieu sélectif Bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVB), sa
fermentation se traduit par un dégagement de gaz dans la cloche de Durham et un trouble
après une incubation à 37°C pour les coliformes totaux et à 44°C pour les coliformes fécaux.
Ш.2.6.2.2. Numération des streptocoques fécaux
La numération des streptocoques fécaux s’effectue en deux étapes :
a) Test présomptif
Il est réalisé sur le milieu de Rothe (séries des trois tubes) :
- Ensemencer chaque série de tubes contenant 10 ml du milieu Rothe simple
concentré, par 1ml de chaque dilution. L’incubation se fait à 37°C pendant 48 h.
- Les tubes présentant un trouble accompagné d’un dépôt blanchâtre sont présumés
de contenir des streptocoques fécaux, ils seront soumis à un test confirmatif.
-
b) Test confirmatif
Chaque tube positif est ensemencé sur bouillon de Eva Litsky, l’incubation s’effectue
pendant 48 h à 37°C. Les tubes présentant un trouble accompagné d’un dépôt formant une
pastille violette, contiennent des streptocoques fécaux.