Matériel et méthodes
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- Technique
- Extraction de l’ADN total
 Préparer l’inoculum bactérien : 3 à 4 colonies dans 50μl d’eau distillée stérile;
 mettre l’inoculum a 100°C pendant 10mn pour la lyse;
 centrifuger à 12000trs/min pendant 3mn;
 récupérer le surnageant;
- Recherche de la présence des gènes Qnr (A,B,S) par PCR multiplexe
La résistance aux quinolones est de type plasmidique pour les gènes Qnr, les protéines qnr
agissant en protégeant les topoisomérase de l’action des quinolones.
 mettre dans des micro tubes 5μl d’ADN additionné de 20μl du mélange réactionnel
 mettre dans l’appareil à PCR pour l’amplification en appliquant le programme
Correspondant : 10min à 95°C, 35cycles de 95°C pendant 1min, 54°C pendant
1 min et 72°C pendant 1min. une élongation finale à 72°C pendant10min.
 Le mélange réactionnel (25µl)
PCR master Mix (2X) (promega)………..……..…...12.5μl
Amorce QnrAm F ……………………….…...…..…0.4 μl
Amorce QnrAm R …………………………….........0.4 μl
Amorce QnrBm F. ………………………………….0.4 μl
Amorce QnrBm R ……………………………….......0.4 μl
Amorce QnrSm F
……………………………......0.4 μl
Amorce QnrSm R ……………………………...........0.4 μl
H 2 O………………………………………………..... 5.1μl
ADN……………………………………………... .......5μl
- Recherche d’aac-(6’)-Ib par PCR simplexe
La recherche du gène aac-Ib a été effectuée dans un volume réactionnel de 12,5µl :
PCR master Mix (2X) (promega)………..……..….........6.25μl
Amorce Aac(6’)-Ib F ……………………….…...…..…0.25 μl
Amorce Aac(6’)-Ib R …………………….......……….0.25μl
H 2 O……………………………………………........…. 3.25μl
ADN....................................................................................2 μl