MATERIEL ET METHODES
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II.3.1.6.Recherche du gène bla CTX-M par PCR
Principe de la PCR
La PCR est une réaction qui permet l’amplification de fragments d’ADN de manière
exponentielle. C’est une réaction cyclique qui repose sur le principe de la réplication de
l’ADN par une ADN polymérase. Mais, dans ce cas, la réplication ne se fait pas entre deux
origines de réplication, mais entre deux amorces se fixant chacune sur un brin de l’ADN
matrice (Branger et al, 2007).Le processus nécessite la succession d’un certain nombre
de cycles (20-40), chaque cycle comporte les étapes suivantes :
- La dénaturation de l’ADN entre 90 – 97 C°.
- L’hybridation : fixation des amorces de part et d’autre du fragment à amplifier (40
-60°C).
- L’élongation : la synthèse du brin d’ADN est assurée par la Taq polymérase à
72°C, en respectant la complémentarité des bases.
Technique
 Extraction de l’ADN total
- Préparer l’inoculum bactérien : 3 à 4 colonies dans 50μl d’eau distillée stérile;
- Mettre l’inoculum à100°C pendant 10mn pour la lyse;
- Centrifuger à 12000trs/min pendant 3mn;
- Récupérer le surnageant;
 Recherche de gènes CTX-M par PCR
Mettre dans des microtubes 2.5μl d’ADN et 10μldu mélange réactionnel. Placer les
microtubes dans l’appareil à PCR pour l’amplification en appliquant le programme
Correspondant qui est de : 94°C pendant 10mn, 30 cycles de 94°C pendant 40sec,
55°C pendant 30sec, 72°C pendant 40sec et une élongation finale de 10mn à 72°C.
Le mélange réactionnel dans un volume de 12.5 μl
PCR master Mix (2X) ………………………………….. 6,25μl
Amorce sences 25 μM …………………………………. 0,25μl
Amorce antisences 25 μM ……………………………… 0,25μl
H 2 O ……………………………………………………... 3,25μl
ADN…………………………………………………….. 2,5μl