MATERIEL ET METHODES
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3.2.1. Extraction de l’ADN
- Préparer l’inoculum bactérien : 3 à 4 colonies dans 50μl d’eau distillée stérile.
- Mettre l’inoculum à 100°C pendant 10mn pour la lyse.
- Centrifuger à 12000trs/min pendant 3mn.
- Récupérer le surnageant.
3.2.2. Détermination des groupes phylogénétiques par PCR :
Principe de la PCR :
La PCR est une réaction qui permet l’amplification de fragments d’ADN de manière
exponentielle. C’est une réaction cyclique qui repose sur le principe de la réplication de
l’ADN par une ADN polymérase. Mais, dans ce cas, la réplication ne se fait pas entre deux
origines de réplication, mais entre deux amorces se fixant chacune sur un brin de l’ADN
matrice (Branger et al, 2007). Le processus nécessite la succession d’un certain nombre
de cycles (20-40), chaque cycle comporte les étapes suivantes :
- La dénaturation de l’ADN entre 90 – 97 C°.
- L’hybridation : fixation des amorces de part et d’autre du fragment à amplifier (40-60°C).
- L’élongation : la synthèse du brin d’ADN est assurée par la Taq polymérase à 72°C, en
respectant la complémentarité des bases.
Recherche des groupes phylogénétiques
Les groupes phylogénétique d’ E. coli ont été déterminés sur la base de l’amplification de
trois marqueurs génétiques selon (Clermont et al., 2000): ChuA : gène nécessaire pour le
transport de l’hème chez E.coli entérohémorragique O157:H7, yjaA : gène de fonction
inconnue identifié chez E.coli K12 et TspE4.C2 : fragment d’ADN anonyme (Tableau1)
Les groupes phylogénétiques sont comme suit: B2 (ChuA+, yjaA+), D (ChuA+, yjaA-), B1
(ChuA-, TspE4.C2+) ou A (ChuA-, TspE4.C2-) (Clermont et al., 2000).
Mélange réactionnel
Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume final de 12.5 μl contenant les
concentrations finales suivantes : PCR Master mix 1X (Proméga), amorces sens et antisens 0,5 μM chacune et 2.5 μl d’ADN.
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3.2.1. Extraction de l’ADN
- Préparer l’inoculum bactérien : 3 à 4 colonies dans 50μl d’eau distillée stérile.
- Mettre l’inoculum à 100°C pendant 10mn pour la lyse.
- Centrifuger à 12000trs/min pendant 3mn.
- Récupérer le surnageant.
3.2.2. Détermination des groupes phylogénétiques par PCR :
Principe de la PCR :
La PCR est une réaction qui permet l’amplification de fragments d’ADN de manière
exponentielle. C’est une réaction cyclique qui repose sur le principe de la réplication de
l’ADN par une ADN polymérase. Mais, dans ce cas, la réplication ne se fait pas entre deux
origines de réplication, mais entre deux amorces se fixant chacune sur un brin de l’ADN
matrice (Branger et al, 2007). Le processus nécessite la succession d’un certain nombre
de cycles (20-40), chaque cycle comporte les étapes suivantes :
- La dénaturation de l’ADN entre 90 – 97 C°.
- L’hybridation : fixation des amorces de part et d’autre du fragment à amplifier (40-60°C).
- L’élongation : la synthèse du brin d’ADN est assurée par la Taq polymérase à 72°C, en
respectant la complémentarité des bases.
Recherche des groupes phylogénétiques
Les groupes phylogénétique d’ E. coli ont été déterminés sur la base de l’amplification de
trois marqueurs génétiques selon (Clermont et al., 2000): ChuA : gène nécessaire pour le
transport de l’hème chez E.coli entérohémorragique O157:H7, yjaA : gène de fonction
inconnue identifié chez E.coli K12 et TspE4.C2 : fragment d’ADN anonyme (Tableau1)
Les groupes phylogénétiques sont comme suit: B2 (ChuA+, yjaA+), D (ChuA+, yjaA-), B1
(ChuA-, TspE4.C2+) ou A (ChuA-, TspE4.C2-) (Clermont et al., 2000).
Mélange réactionnel
Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume final de 12.5 μl contenant les
concentrations finales suivantes : PCR Master mix 1X (Proméga), amorces sens et antisens 0,5 μM chacune et 2.5 μl d’ADN.