Chapitre III:
Matériel et méthodes.
33
Figure 21: Droite d'étalonnage de la chlorophylle à 670
nm.
Tableau 2: Concentration des standards avant et après
cidification.
V.6. Mesure de l’intensité de fluorescence
Les experts de la C.O.I (1982), ont établi des conditions opératoires pour la mesure de l‟intensité
de fluorescence des mélanges de pigments présents dans la chlorophylle. Ces conditions disent que la
lecture des intensités de fluorescence (IF) exige d‟opérer dans les plus fortes longueurs, et qui sont les
suivantes:
- Longueur d‟onde d‟excitation : 450 nm ;
- Longueur d‟onde d‟émission : 670 nm ;
Les fentes d‟excitation et d‟émission sont respectivement fixées à 2 nm et 20 nm.
- Après que ces conditions soient établie, on mesure l‟Intensité de fluorescence IF 0 ;
- Ajouter 10 µl d'HCl dans la cellule, attendre 1 min puis lire l‟intensité de fluorescence IFa.
V.7. Mode de calcul des concentrations
Les concentrations de chlorophylle dans les extraits du méthanol sont déterminées à partir de la
droite d‟étalonnage.
L‟intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration de la chlorophylle. Cette
relation est proportionnalité est une droite de la forme :
+ b
Où :
IF: Intensité de fluorescence en Unité Arbitraire (U.A).
a : Pente de la droite.
x : Concentration de la chlorophylle dans l‟extrait en µg/l.
b : Ordonnée à l‟origine.
La méthode apporte une correction pour la présence de phéopigments a, laquelle absorbe à une
longueur d‟onde voisine de la chlorophylle a. La mesure fluorométrique est effectuée avant acidification
et après une acidification qui transforme toute la chlorophylle a en phéopigments a laquelle émet de la
fluorescence avec moins d‟intensité. Cette opération permet de corriger l‟interférence des phéopigment a
sur la chlorophylle a et, du même coup, de doser la phéopigment a.
Les concentrations du pigment phéopigment a et chlorophylle a sont mesurées selon la relation
Les concentrations de la chlorophylle a sont évaluées d‟après les formules de Lorenzen (1966) (in
Aminot et Chausse-Pied, 1983):
IF 0 IFa Concentration (µg/L)
Méthanol
0
0
0
STD1
0,2
0,1
2
STD2
0,7
0,3
5
STD3
1,7
0,5
10
STD4
2,6
0,8
15
STD5
3,5
1
20
y = 0,050x + 0,012
R² = 0,995
y = 0,179x - 0,107
R² = 0,997
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0
5
10
15
20
25
Intensité
de
fluorescence
(U.A)
Concentration (µg/L)
Matériel et méthodes.
33
Figure 21: Droite d'étalonnage de la chlorophylle à 670
nm.
Tableau 2: Concentration des standards avant et après
cidification.
V.6. Mesure de l’intensité de fluorescence
Les experts de la C.O.I (1982), ont établi des conditions opératoires pour la mesure de l‟intensité
de fluorescence des mélanges de pigments présents dans la chlorophylle. Ces conditions disent que la
lecture des intensités de fluorescence (IF) exige d‟opérer dans les plus fortes longueurs, et qui sont les
suivantes:
- Longueur d‟onde d‟excitation : 450 nm ;
- Longueur d‟onde d‟émission : 670 nm ;
Les fentes d‟excitation et d‟émission sont respectivement fixées à 2 nm et 20 nm.
- Après que ces conditions soient établie, on mesure l‟Intensité de fluorescence IF 0 ;
- Ajouter 10 µl d'HCl dans la cellule, attendre 1 min puis lire l‟intensité de fluorescence IFa.
V.7. Mode de calcul des concentrations
Les concentrations de chlorophylle dans les extraits du méthanol sont déterminées à partir de la
droite d‟étalonnage.
L‟intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration de la chlorophylle. Cette
relation est proportionnalité est une droite de la forme :
+ b
Où :
IF: Intensité de fluorescence en Unité Arbitraire (U.A).
a : Pente de la droite.
x : Concentration de la chlorophylle dans l‟extrait en µg/l.
b : Ordonnée à l‟origine.
La méthode apporte une correction pour la présence de phéopigments a, laquelle absorbe à une
longueur d‟onde voisine de la chlorophylle a. La mesure fluorométrique est effectuée avant acidification
et après une acidification qui transforme toute la chlorophylle a en phéopigments a laquelle émet de la
fluorescence avec moins d‟intensité. Cette opération permet de corriger l‟interférence des phéopigment a
sur la chlorophylle a et, du même coup, de doser la phéopigment a.
Les concentrations du pigment phéopigment a et chlorophylle a sont mesurées selon la relation
Les concentrations de la chlorophylle a sont évaluées d‟après les formules de Lorenzen (1966) (in
Aminot et Chausse-Pied, 1983):
IF 0 IFa Concentration (µg/L)
Méthanol
0
0
0
STD1
0,2
0,1
2
STD2
0,7
0,3
5
STD3
1,7
0,5
10
STD4
2,6
0,8
15
STD5
3,5
1
20
y = 0,050x + 0,012
R² = 0,995
y = 0,179x - 0,107
R² = 0,997
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0
5
10
15
20
25
Intensité
de
fluorescence
(U.A)
Concentration (µg/L)