Chapitre III:
Matériel et méthodes.
32
V.2.2.Tubes de mesure
Pour l‟extraction, des tubes en verre avec bouchon enveloppés au préalable avec du papier
aluminium pour éviter l‟exposition des filtres à la lumière sont utilisés.
V.2.3. Centrifugeuse
Centrifugeuse Hettich ZENTRIFUGEN de type EBA 30, avec 12 postes de porte-Filtre.
V.2.4. Spectrophotomètre fluorescence
L‟appareil utilisé pour la mesure de la chlorophylle est un spectrophotomètre de Fluorescence
HITACHI, modèle 650 S, équipé d‟une lampe « Xénon » qui est la source du rayonnement UV et des
cellules en quartz de 1 cm de trajet optique (Annexe 6, Figure 3).
V.3. Réactifs
o Suspension carbonate de magnésium MgCO 3 à 1 % ;
o Solvant d'extraction : Méthanol pur pour analyse à 99,7 % ;
o Solution d'acide chloridrique 0,5N.
V.4. Mode opératoire
o Les échantillons d'eau de mer (250 ml) sont prélevés sur les bouteilles Niskin de la rosette ;
o Les échantillons de la première sortie sont contenus dans des flacons de 250 ml et sont mis
directement après leur prélèvement à l‟ombre et mis au congélateur pour leur conservation, alors que lors
de la deuxième sortie, les échantillons sont filtrés directement ;
o Pour les deux sortie, la filtration c‟est faite sur des filtres en fibre de verre Whatman GF/F de
diamètre 25 mm, après ajout de quelques gouttes de MgCO 3 ;
o La dépression utilisée est toujours inférieure à 100 mmHg. Immédiatement après la filtration, le
filtre est plié sur quatre et enrobé dans du papier aluminium déjà étiqueté. Ensuite les filtre sont conservés
dans un congélateur ;
o Mettre le filtre dans un tube après son conditionnement avec du méthanol ;
o Ajouter 7 ml de méthanol à 99,7 % dans le tube contenant le filtre ;
o Le tube est ensuite bouché et placé à l‟obscurité dans un réfrigérateur (5 °C), pour une période
d'extraction de 30 minutes.
o Après 30 minutes d‟extraction, placé dans la centrifugeuse à 3000 tours/min, pendant 2 minutes ;
o Allumer l'appareil et la lampe une heure avant les mesures ;
o Régler le zéro de l'appareil avec un tube témoin contenant un filtre vierge ayant subi les mêmes
traitements que les échantillons, excepté la filtration du plancton ;
o Après ce délai la fluorescence de l'échantillon est mesurée sur le spectrophotomètre fluorescence
dans la cellule en quartz ;
V.5. Etalonnage (Figure 21)
Les experts de la COI (1984) recommandent l‟utilisation d‟une solution de chlorophylle pure
comme étalon de référence.
L‟étalonnage est réalisé à l‟aide d‟une série de cinq standards, et un blanc du méthanol une droite
d‟étalonnage de la chlorophylle.
V.5.1. Préparation des standards
Les standards STD1, STD2, STD3, STD4 et STD5 sont préparés à partir de la solution de
chlorophylle pure de concentration 100 µg/ml. Ils sont obtenus par dissolution de 1 mg de chlorophylle
pure dans 10 ml de méthanol (Tableau 2).
Matériel et méthodes.
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V.2.2.Tubes de mesure
Pour l‟extraction, des tubes en verre avec bouchon enveloppés au préalable avec du papier
aluminium pour éviter l‟exposition des filtres à la lumière sont utilisés.
V.2.3. Centrifugeuse
Centrifugeuse Hettich ZENTRIFUGEN de type EBA 30, avec 12 postes de porte-Filtre.
V.2.4. Spectrophotomètre fluorescence
L‟appareil utilisé pour la mesure de la chlorophylle est un spectrophotomètre de Fluorescence
HITACHI, modèle 650 S, équipé d‟une lampe « Xénon » qui est la source du rayonnement UV et des
cellules en quartz de 1 cm de trajet optique (Annexe 6, Figure 3).
V.3. Réactifs
o Suspension carbonate de magnésium MgCO 3 à 1 % ;
o Solvant d'extraction : Méthanol pur pour analyse à 99,7 % ;
o Solution d'acide chloridrique 0,5N.
V.4. Mode opératoire
o Les échantillons d'eau de mer (250 ml) sont prélevés sur les bouteilles Niskin de la rosette ;
o Les échantillons de la première sortie sont contenus dans des flacons de 250 ml et sont mis
directement après leur prélèvement à l‟ombre et mis au congélateur pour leur conservation, alors que lors
de la deuxième sortie, les échantillons sont filtrés directement ;
o Pour les deux sortie, la filtration c‟est faite sur des filtres en fibre de verre Whatman GF/F de
diamètre 25 mm, après ajout de quelques gouttes de MgCO 3 ;
o La dépression utilisée est toujours inférieure à 100 mmHg. Immédiatement après la filtration, le
filtre est plié sur quatre et enrobé dans du papier aluminium déjà étiqueté. Ensuite les filtre sont conservés
dans un congélateur ;
o Mettre le filtre dans un tube après son conditionnement avec du méthanol ;
o Ajouter 7 ml de méthanol à 99,7 % dans le tube contenant le filtre ;
o Le tube est ensuite bouché et placé à l‟obscurité dans un réfrigérateur (5 °C), pour une période
d'extraction de 30 minutes.
o Après 30 minutes d‟extraction, placé dans la centrifugeuse à 3000 tours/min, pendant 2 minutes ;
o Allumer l'appareil et la lampe une heure avant les mesures ;
o Régler le zéro de l'appareil avec un tube témoin contenant un filtre vierge ayant subi les mêmes
traitements que les échantillons, excepté la filtration du plancton ;
o Après ce délai la fluorescence de l'échantillon est mesurée sur le spectrophotomètre fluorescence
dans la cellule en quartz ;
V.5. Etalonnage (Figure 21)
Les experts de la COI (1984) recommandent l‟utilisation d‟une solution de chlorophylle pure
comme étalon de référence.
L‟étalonnage est réalisé à l‟aide d‟une série de cinq standards, et un blanc du méthanol une droite
d‟étalonnage de la chlorophylle.
V.5.1. Préparation des standards
Les standards STD1, STD2, STD3, STD4 et STD5 sont préparés à partir de la solution de
chlorophylle pure de concentration 100 µg/ml. Ils sont obtenus par dissolution de 1 mg de chlorophylle
pure dans 10 ml de méthanol (Tableau 2).