Chapitre II : Méthode d’identification
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2. 2.10 Séquençage de l’ADN:
L’ADN à séquencer est appelé ADN matrice, il doit être obtenu sous forme purifié et être
homogène (il ne doit contenir que des molécules d’ADN ayant la même séquence). On utilise
couramment comme matrice de l’ADN cloné ou produit par PCR. Cet ADN simple brin est
obtenu par dénaturation de la matrice d’ADN double brin via un traitement thermique ou
alcalin (Khazaal, et al., 2005).
Pour le séquençage on utilise de nombreuses ADN polymérases: fragment de Klenow
(une partie de l’ADN polymérase I d’E. coli), une ADN polymérase modifiée tirée du phage T
appelée la séquenase et la Taq ADN polymérase qui est aussi utilisée en PCR(Khazaal, et al.,
2005).
Toutes ces ADN polymérases ont besoin d’une petite région d’ADN double brin pour
pouvoir initier la synthèse d’ADN à partir d’une matrice simple brin. Celle ci est fournie par
addition, dans le milieu réactionnel, de petites molécules d’ADN simple brin appelées primers
(amorces) oligonucléotidiques qui s’apparient à l’ADN matrice par complémentarité des
bases et déterminent ainsi le point où commencera le séquençage (Khazaal, et al., 2005).
On prépare 4 milieux réactionnels différents.
Tous contiennent: l’ADN matrice sous forme simple brin, de l’ADN polymérase, des
amorces, les 4 désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), souvent sont les briques
nécessaires à la construction du nouvel ADN. Chacun contient un nucléotide modifié
différent, appelé un didésoxyribonucléotide (ddNTP).
Il y a 4 ddNTP qui correspondent aux 4 bases de l’ADN. Ils diffèrent des dNTP par
l’absence de groupe hydroxyle sur le carbone 3’ du sucre. Ils sont incorporés à l’ADN en
croissance par la polymérase, mais cette absence de l’hydroxyle en 3’ empêche de former un
lien phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite. Ceci interdit de
poursuivre l’élongation du polynucléotide d’ADN en cours de synthèse. Les ddNTP jouent
ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN. Chacun des 4 milieux réactionnels
préparés pour le séquençage contient un ddNTP différent. Suivant le ddNTP qui est présent, la
synthèse se termine à l’endroit ou ce nucléotide modifié est incorporé. À tout moment, durant
la synthèse d’ADN, la polymérase peut incorporer à la chaîne en élongation soit un dNTP soit
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2. 2.10 Séquençage de l’ADN:
L’ADN à séquencer est appelé ADN matrice, il doit être obtenu sous forme purifié et être
homogène (il ne doit contenir que des molécules d’ADN ayant la même séquence). On utilise
couramment comme matrice de l’ADN cloné ou produit par PCR. Cet ADN simple brin est
obtenu par dénaturation de la matrice d’ADN double brin via un traitement thermique ou
alcalin (Khazaal, et al., 2005).
Pour le séquençage on utilise de nombreuses ADN polymérases: fragment de Klenow
(une partie de l’ADN polymérase I d’E. coli), une ADN polymérase modifiée tirée du phage T
appelée la séquenase et la Taq ADN polymérase qui est aussi utilisée en PCR(Khazaal, et al.,
2005).
Toutes ces ADN polymérases ont besoin d’une petite région d’ADN double brin pour
pouvoir initier la synthèse d’ADN à partir d’une matrice simple brin. Celle ci est fournie par
addition, dans le milieu réactionnel, de petites molécules d’ADN simple brin appelées primers
(amorces) oligonucléotidiques qui s’apparient à l’ADN matrice par complémentarité des
bases et déterminent ainsi le point où commencera le séquençage (Khazaal, et al., 2005).
On prépare 4 milieux réactionnels différents.
Tous contiennent: l’ADN matrice sous forme simple brin, de l’ADN polymérase, des
amorces, les 4 désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), souvent sont les briques
nécessaires à la construction du nouvel ADN. Chacun contient un nucléotide modifié
différent, appelé un didésoxyribonucléotide (ddNTP).
Il y a 4 ddNTP qui correspondent aux 4 bases de l’ADN. Ils diffèrent des dNTP par
l’absence de groupe hydroxyle sur le carbone 3’ du sucre. Ils sont incorporés à l’ADN en
croissance par la polymérase, mais cette absence de l’hydroxyle en 3’ empêche de former un
lien phosphodiester avec le nucléotide qui devrait être ajouté ensuite. Ceci interdit de
poursuivre l’élongation du polynucléotide d’ADN en cours de synthèse. Les ddNTP jouent
ainsi le rôle d’inhibiteurs de la synthèse de l’ADN. Chacun des 4 milieux réactionnels
préparés pour le séquençage contient un ddNTP différent. Suivant le ddNTP qui est présent, la
synthèse se termine à l’endroit ou ce nucléotide modifié est incorporé. À tout moment, durant
la synthèse d’ADN, la polymérase peut incorporer à la chaîne en élongation soit un dNTP soit