Chapitre II : Méthode d’identification
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2. les sondes fluorescentes.(hydrolyse de sondes (Taqmanassay), ces différentes
technologies de détection auraient une sensibilité équivalente. Cependant, ces
technologies présentent des différences au niveau de la spécificité (Bustin, 2000)
Les sondes fluorescentes possèdent comme avantage par rapport aux agents se liant à
l’ADN une spécificité accrue et une meilleure capacité de multiplexage. La spécificité
d’hybridation entre la sonde fluorescente et sa séquence d’ADN cible réduit significativement
l’émission defluorescence non spécifique due à des mauvais appariements ou des dimères
d’amorces (primer-dimers) (Poitras,et al., 2002).
Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont présentés sur le marché. Ces
appareils utilisent généralement un système en tubes fermés et la quantification ne requiert
aucune manipulation post amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de
contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR et réduit le temps d’analyse
(Bustin, 2000).
Cycle seuil (Threshold cycle)
Le concept du « cycle seuil » est à la base d’une quantification précise et reproductible
pour les techniques fluorescentes en PCR (figure11). Les valeurs de fluorescence
sontenregistrées au cours de chaque cycle et représentent la quantité d’amplicons produits en
un point précis dans la réaction (figure 11). Plus il y a de matrices (template) à amplifier au
départ de la réaction PCR, moins élevé sera le nombre de cycle requis pour atteindre un point
où le signal d’émission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé
que le bruit de fond (Gibson, et al., 1996). Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct)
et apparaîtra toujours au cours de la phase exponentielle d’amplification. Par conséquent, la
quantification n’est pas affectée par l’épuisement d’un des réactifs comme lors de la phase
plateau ce qui explique pourquoi le système en temps réel est si reproductible. La valeur du Ct
peut être traduite en un résultat quantitatif en la comparant avec les valeurs du Ct générées
avec des matrices de quantification connues (Bustin, 2000)
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2. les sondes fluorescentes.(hydrolyse de sondes (Taqmanassay), ces différentes
technologies de détection auraient une sensibilité équivalente. Cependant, ces
technologies présentent des différences au niveau de la spécificité (Bustin, 2000)
Les sondes fluorescentes possèdent comme avantage par rapport aux agents se liant à
l’ADN une spécificité accrue et une meilleure capacité de multiplexage. La spécificité
d’hybridation entre la sonde fluorescente et sa séquence d’ADN cible réduit significativement
l’émission defluorescence non spécifique due à des mauvais appariements ou des dimères
d’amorces (primer-dimers) (Poitras,et al., 2002).
Plusieurs instruments de PCR en temps réel sont présentés sur le marché. Ces
appareils utilisent généralement un système en tubes fermés et la quantification ne requiert
aucune manipulation post amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de
contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR et réduit le temps d’analyse
(Bustin, 2000).
Cycle seuil (Threshold cycle)
Le concept du « cycle seuil » est à la base d’une quantification précise et reproductible
pour les techniques fluorescentes en PCR (figure11). Les valeurs de fluorescence
sontenregistrées au cours de chaque cycle et représentent la quantité d’amplicons produits en
un point précis dans la réaction (figure 11). Plus il y a de matrices (template) à amplifier au
départ de la réaction PCR, moins élevé sera le nombre de cycle requis pour atteindre un point
où le signal d’émission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé
que le bruit de fond (Gibson, et al., 1996). Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct)
et apparaîtra toujours au cours de la phase exponentielle d’amplification. Par conséquent, la
quantification n’est pas affectée par l’épuisement d’un des réactifs comme lors de la phase
plateau ce qui explique pourquoi le système en temps réel est si reproductible. La valeur du Ct
peut être traduite en un résultat quantitatif en la comparant avec les valeurs du Ct générées
avec des matrices de quantification connues (Bustin, 2000)