Chapitre II : Méthode d’identification
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La plupart du temps, la PCR sera suivie d'une analyse par électrophorèse du matériel
amplifié. Les fragments obtenus sont séparés par migration sur gel d’agarose (les
concentrations d’agarose sont comprises entre 0,6 et 1,5 %, les tailles des fragments à séparer
sont comprises entre 0,5 et 20 Kb) sous l'action d'un champ électrique (Khazaal, et al., 2005).
Ces différents fragments sont ensuite rendus visibles par des colorants ayant une affinité
pour l'ADN tels le bromure d'éthidium, SYBR Safe, le SYBR Green I, le SYBR Gold et le
GelRed, et alors on peut distinguer entre 2 espèces selon la répartition différente des
fragments, qui est spécifique pour chacune de ces espèces (Khazaal, et al., 2005).
2. 2.3 LA PCR multiplex
Le terme de "PCR multiplexe" désigne une mise au point de la technique PCR
autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. Les
couples d'amorces correspondant aux différents locus à analyser sont introduits dans le même
tube réactionnel. Les conditions d'amplification étant fixées pour un même tube dans lequel
ont lieu plusieurs réactions différentes, le choix de ces conditions résulte d'une mise au point
poussée. En particulier, le choix des couples d'amorces doit être rigoureux pour pouvoir
trouver un compromis entre les températures d’hybridation et les durées d'élongation
optimales de chacune des réactions de PCR . Le premier avantage de cette adaptation
technique est la réduction du coût et la diminution du temps de réalisation et, éventuellement,
d'analyse des résultats (Ben Salem, 2007).
A la fin de la réaction, les différents produits d'amplification sont effectivement
mélangés dans le tube réactionnel. Il est possible de les séparer par électrophorèse. chaque
bande observée correspond à une région spécifique de l’ADN (Edward,et al.,1994). Mais il
est vrai que pour un certain nombre de raisons, les segments coamplifiés ne peuvent que se
situer dans une gamme restreinte de tailles et il est à craindre que, pour certains d'entre-eux,
ces tailles soient très proches ou même, se chevauchent (Khazaal, et al., 2005).Pour les
distinguer facilement, les techniciens des laboratoires agréés utilisent en fait des amorces
couplées à des fluorochromes de couleurs d'émission différentes. Les résultats sont alors
présentés, non pas sous la forme bien connue de codes-barres, mais sous la forme d'une
succession de "pics" de couleurs différentes (Khazaal, et al., 2005).
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La plupart du temps, la PCR sera suivie d'une analyse par électrophorèse du matériel
amplifié. Les fragments obtenus sont séparés par migration sur gel d’agarose (les
concentrations d’agarose sont comprises entre 0,6 et 1,5 %, les tailles des fragments à séparer
sont comprises entre 0,5 et 20 Kb) sous l'action d'un champ électrique (Khazaal, et al., 2005).
Ces différents fragments sont ensuite rendus visibles par des colorants ayant une affinité
pour l'ADN tels le bromure d'éthidium, SYBR Safe, le SYBR Green I, le SYBR Gold et le
GelRed, et alors on peut distinguer entre 2 espèces selon la répartition différente des
fragments, qui est spécifique pour chacune de ces espèces (Khazaal, et al., 2005).
2. 2.3 LA PCR multiplex
Le terme de "PCR multiplexe" désigne une mise au point de la technique PCR
autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. Les
couples d'amorces correspondant aux différents locus à analyser sont introduits dans le même
tube réactionnel. Les conditions d'amplification étant fixées pour un même tube dans lequel
ont lieu plusieurs réactions différentes, le choix de ces conditions résulte d'une mise au point
poussée. En particulier, le choix des couples d'amorces doit être rigoureux pour pouvoir
trouver un compromis entre les températures d’hybridation et les durées d'élongation
optimales de chacune des réactions de PCR . Le premier avantage de cette adaptation
technique est la réduction du coût et la diminution du temps de réalisation et, éventuellement,
d'analyse des résultats (Ben Salem, 2007).
A la fin de la réaction, les différents produits d'amplification sont effectivement
mélangés dans le tube réactionnel. Il est possible de les séparer par électrophorèse. chaque
bande observée correspond à une région spécifique de l’ADN (Edward,et al.,1994). Mais il
est vrai que pour un certain nombre de raisons, les segments coamplifiés ne peuvent que se
situer dans une gamme restreinte de tailles et il est à craindre que, pour certains d'entre-eux,
ces tailles soient très proches ou même, se chevauchent (Khazaal, et al., 2005).Pour les
distinguer facilement, les techniciens des laboratoires agréés utilisent en fait des amorces
couplées à des fluorochromes de couleurs d'émission différentes. Les résultats sont alors
présentés, non pas sous la forme bien connue de codes-barres, mais sous la forme d'une
succession de "pics" de couleurs différentes (Khazaal, et al., 2005).