Chapitre III
Matériel et méthodes
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2.5.3.4 Mesure d’absorbance
-Récupérer les tubes et les mettre dans le portoir tout on évitant la lumière.
-Transférer le surnageant de centrifugation dans la cuve de spectromètre ; on évite
l’entrainement de fibres de verre en aspirant l’extrait à l’aide, par exemple, d’une seringue de
verre.
-Mettre la cuve en place et s’assurer de son positionnement correct.
-Mesurer les absorbances brutes des extraits non acidifiés aux longueurs d’ondes de
665 et 750 nm (figure 14.e), soit Ab665na et Ab750na. La mesure à 750 nm doit être restée
inférieur à 0,005 par centimètre de trajet optique.
-Acidifier par addition de 10 μl d’acide chlorhydrique 0,3 mol/l par millilitre d’extrait
(Soit une goute pour environ 5 ml) directement dans la cuve et attendre 2 à 3 min
-Mesurer les absorbances brutes des extraits acidifiés à 665 et 750 nm, soit Ab665a etAb750a.
a
b
c
d
Centrifugeus
Spectrophotomètre
e
Figure 14 : Photos des étapes de dosage de la chlorophylle a
2.5.4 Calcule et expression des résultats :
Les absorbances brutes à 665 nm et les blancs de turbidité à 750 nm doivent être corrigés en
soustrayant les blancs des cuves puis on obtient les absorbances nettes en soustrayant les
absorbances corrigés mesurés à 750 nm des absorbances corrigées mesurées à 665 nm, c’est
à- dire :
 Avant acidification :
A665na = (Ab665na - bc665) – (Ab750na –bc750) … (III.3)
 Après acidification:
A665a= (Ab665a - bc665) – (Ab750a –bc750) … (III.4)
Les autres données sont :
- V : volume d’eau filtrée (litres).
- v : volume de solvant d’extraction (millilitres).
- l : longueur de trajet optique de la cuve de mesure (centimètre).
La concentration de chlorophylle a est calculée d’après la relation suivante :
[Chlorophyll a](ug/l) = 27.7* (A
NA
665 - A
A
665 ) * … (III.5)