Chapitre III : MATERIELS ET METHODES
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2.4.3.3 Mesure de la chlorophylle " a " par leSpectrofluorimètre(méthode fluorimétrique
sans acidification)
Elle a été élaborée dans le cas où la mesure des phèopigments n’est pas utile. L’extraction est
effectuée à l’acétone 90% et le spéctrofluorimétre est étalonné selon la procédure normale
mais sans acidification, la fluorescence des échantillons est lue et convertie directement en
chlorophylle " a " en la multipliant par le coefficient d’étalonnage « k » (AMINOT et
KEROUEL, 2004)
2.4.3.3.1 Principe de Spectrofluorimètre:
Cette méthode présente l’avantage d’être très sensible et ne nécessite qu’un faible volume
d’échantillon, elle est préférée à la méthode spectrophotométrique, qui manque de sensibilité
(CEAEQ, 2003).
La méthode fluorimétrique utilise la propriété d’émission des pigments chlorophylliens dans
le rouge, lorsqu’ils sont excités par la lumière bleue ou ultra-violette. Le Spectrofluorimètre
doit donc être équipé d'une lampe émettant dans le bleu, d’un filtre d’excitation bleu (420450nm) et d’un filtre d’émission rouge (> 665nm). La méthode est basée sur la mesure de
fluorescence de l’échantillon sans acidification(AMINOT et KEROUEL, 2004).
2.4.3.3.2 Mesure du blanc
Le blanc constitué d’acétone à 90% est mesuré avant chaque série d’échantillon. Il permet de
régler le zéro de l’appareil.
2.4.3.3.3 Contrôle de Qualité :
La justesse des mesures doit être contrôlée à l’aide du standard solide de chlorophylle
(chlorophylle"a"fromspinach : 1mg ; refC-5753 chez Sigma-Aldrich).Ce standard doit être
mesuré le jour de l’étalonnage puis chaque fois que l’on mesure un lot d’échantillons. Ces
mesures permettent de vérifier l'absence de dérive de l'appareillage et donc de valider
l’adéquation avec la courbe d’étalonnage.
2.4.3.3.4 Mesure de la fluorescence des échantillons
• Sortir les tubes du réfrigérateur, Agiter les tubes ;
• Peser les tubes et les classer selon leurs poids approximatifs.
• Placer les tubes qui ont approximativement le même poids à la centrifugeuse face à
face, pour éviter leurs endommagement. ;
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2.4.3.3 Mesure de la chlorophylle " a " par leSpectrofluorimètre(méthode fluorimétrique
sans acidification)
Elle a été élaborée dans le cas où la mesure des phèopigments n’est pas utile. L’extraction est
effectuée à l’acétone 90% et le spéctrofluorimétre est étalonné selon la procédure normale
mais sans acidification, la fluorescence des échantillons est lue et convertie directement en
chlorophylle " a " en la multipliant par le coefficient d’étalonnage « k » (AMINOT et
KEROUEL, 2004)
2.4.3.3.1 Principe de Spectrofluorimètre:
Cette méthode présente l’avantage d’être très sensible et ne nécessite qu’un faible volume
d’échantillon, elle est préférée à la méthode spectrophotométrique, qui manque de sensibilité
(CEAEQ, 2003).
La méthode fluorimétrique utilise la propriété d’émission des pigments chlorophylliens dans
le rouge, lorsqu’ils sont excités par la lumière bleue ou ultra-violette. Le Spectrofluorimètre
doit donc être équipé d'une lampe émettant dans le bleu, d’un filtre d’excitation bleu (420450nm) et d’un filtre d’émission rouge (> 665nm). La méthode est basée sur la mesure de
fluorescence de l’échantillon sans acidification(AMINOT et KEROUEL, 2004).
2.4.3.3.2 Mesure du blanc
Le blanc constitué d’acétone à 90% est mesuré avant chaque série d’échantillon. Il permet de
régler le zéro de l’appareil.
2.4.3.3.3 Contrôle de Qualité :
La justesse des mesures doit être contrôlée à l’aide du standard solide de chlorophylle
(chlorophylle"a"fromspinach : 1mg ; refC-5753 chez Sigma-Aldrich).Ce standard doit être
mesuré le jour de l’étalonnage puis chaque fois que l’on mesure un lot d’échantillons. Ces
mesures permettent de vérifier l'absence de dérive de l'appareillage et donc de valider
l’adéquation avec la courbe d’étalonnage.
2.4.3.3.4 Mesure de la fluorescence des échantillons
• Sortir les tubes du réfrigérateur, Agiter les tubes ;
• Peser les tubes et les classer selon leurs poids approximatifs.
• Placer les tubes qui ont approximativement le même poids à la centrifugeuse face à
face, pour éviter leurs endommagement. ;