Matériel et méthodes
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II.5.1 Coloration de Gram
Principe :
La coloration de Gram est une coloration différentielle, qui permet de diviser les bactéries en
deux classes : les Gram-négatifs et les Gram-positifs. (WILLEY J.M. et al., 2017). Elle est
principalement liée à une différence de structure chimique des parois cellulaires des bactéries.
(DENIS F. et al., 2012 ; WILLEY J.M.et al., 2017 ).
Technique :
1. Préparation du frottis :
 Placer une goutte d’eau distillée stérile sur la lame.
 Prélever stérilement les bactéries à partir des boites de pétri.
 Emulsionner et étaler sur la lame avec l’anse de platine.
 Sécher la lame en dessus de 20à 30cm de la flamme du bec bensun.
 Fixer à la chaleur et passer la lame 3fois dans la flamme du bec puis laisser refroidir.
2. La coloration :
 Recouvrir le frottis fixé de violet de gentiane, laisser agir 1min.
 Rincer la lame avec l’eau distillée.
 Recouvrir avec solution de lugol, laisser agir 1min.
 Rincer la lame avec l’eau distillée.
 Décolorer le frottis avec l’alcool à 95° pendant 30sec.
 Rincer la lame avec l’eau distillée.
 Recouvrir avec la solution de fushine et laisser agir 1min.
 Laver à l’eau distillée. Sécher la lame avec du papier.
3. Observation :
Observer à l’objectif x40 et x100 (plus une goutte de l’huile à immersion).
Lecture :
 Les bactéries à Gram positif apparaissent en violet au microscope optique.
 Les bactéries à Gram négatif apparaissent en rose au microscope.