Chapitre Ⅲ : matériel et méthodes
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III.5 Identification moléculaire
Dans le cadre de notre étude, les souches ont été fournies avec leurs séquences brutes. La
caractérisation moléculaire des isolats a été basée sur l’analyse de la séquence du gène de l’ARN
ribosomal 16S (ARNr).
L’ADN bactérien a été extrait suivant la méthode de « colonie PCR » (China et al., 1996). C’est
une méthode basée sur le choc thermique. Les colonies isolées et purifiées sont immergées dans
25 μl de TE dans des microtubes de 1,5 ml. Les tubes sont ensuite immergés dans de l'eau
bouillante avec un flotteur pendant cinq minutes, puis mis sur de la glace pendant 5 minutes
supplémentaires et enfin centrifugés pendant 5 minutes à 13 000 g. Au cours de ce processus,
l’ADN est obtenu sous forme de surnageant.
L'amplification PCR du gène de l'ARNr 16S a été réalisée en utilisant le couple d’amorce
Bac27_F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) et de l'amorce inverse universelle Uni_1492R
(5’-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3’) (Lane, 1991 ; Frank et al., 2008). La réaction
d'amplification a été réalisée dans un volume réactionnel final de 30 μl contenant 1 μl d'ADN,
0,6 μl de chaque amorce, 0,6 μl de desoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs 0,2 mM) (Gibco,
Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 0,5 U de Taq polymerase (Qiagen, Milano, Italie) avec son
tampon réactionnel 1× final. La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler
Gradient,Eppendorf) en suivant un programme de cycles bien définie.
Les fragments d'ADNr 16S amplifiés ont été séquencés par le biais de Macrogen Europe Service
(Amsterdam, Pays-Bas).
Ayant les séquences de chaque bactérie (Annex 1), on les a comparés avec les séquences de la
banque de données dans Genbank-BLASTn, pour une éventuelle identification moléculaire.
III.6 Caractérisations biochimiques des bactéries isolées
III.6.1 Coloration de Gram
C’est un test qui permet la distinction entre deux groupes bactériens, les Gram + et les Gram-,
Cette différence vient de la présence du maillage du peptidoglycane au niveau de la membrane,
ce maillage est énorme chez les bactéries Gram+, et minuscule chez les bactéries Gram-.
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III.5 Identification moléculaire
Dans le cadre de notre étude, les souches ont été fournies avec leurs séquences brutes. La
caractérisation moléculaire des isolats a été basée sur l’analyse de la séquence du gène de l’ARN
ribosomal 16S (ARNr).
L’ADN bactérien a été extrait suivant la méthode de « colonie PCR » (China et al., 1996). C’est
une méthode basée sur le choc thermique. Les colonies isolées et purifiées sont immergées dans
25 μl de TE dans des microtubes de 1,5 ml. Les tubes sont ensuite immergés dans de l'eau
bouillante avec un flotteur pendant cinq minutes, puis mis sur de la glace pendant 5 minutes
supplémentaires et enfin centrifugés pendant 5 minutes à 13 000 g. Au cours de ce processus,
l’ADN est obtenu sous forme de surnageant.
L'amplification PCR du gène de l'ARNr 16S a été réalisée en utilisant le couple d’amorce
Bac27_F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) et de l'amorce inverse universelle Uni_1492R
(5’-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3’) (Lane, 1991 ; Frank et al., 2008). La réaction
d'amplification a été réalisée dans un volume réactionnel final de 30 μl contenant 1 μl d'ADN,
0,6 μl de chaque amorce, 0,6 μl de desoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs 0,2 mM) (Gibco,
Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 0,5 U de Taq polymerase (Qiagen, Milano, Italie) avec son
tampon réactionnel 1× final. La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler
Gradient,Eppendorf) en suivant un programme de cycles bien définie.
Les fragments d'ADNr 16S amplifiés ont été séquencés par le biais de Macrogen Europe Service
(Amsterdam, Pays-Bas).
Ayant les séquences de chaque bactérie (Annex 1), on les a comparés avec les séquences de la
banque de données dans Genbank-BLASTn, pour une éventuelle identification moléculaire.
III.6 Caractérisations biochimiques des bactéries isolées
III.6.1 Coloration de Gram
C’est un test qui permet la distinction entre deux groupes bactériens, les Gram + et les Gram-,
Cette différence vient de la présence du maillage du peptidoglycane au niveau de la membrane,
ce maillage est énorme chez les bactéries Gram+, et minuscule chez les bactéries Gram-.