106 DeUXiÈMe partie La cellule
Les électrons qui traversent l’échantillon sont plutôt dispersés
dans les régions plus denses, de sorte que moins d’électrons
sont transmis (ces régions paraissent plus sombres). L’image
révèle la disposition des électrons transmis. Au lieu de comporter des lentilles de verre, le microscope électro nique à transmission fonctionne au moyen d’électroaimants qui mettent
l’image au point et la grossissent en déviant la trajectoire des
électrons. L’image est finalement projetée sur un écran.
Les microscopes électroniques ont permis de découvrir un
grand nombre d’organites et une quantité d’autres structures
subcellulaires invi sibles au microscope photonique. Toutefois, le MP a des avantages, notamment celui de permettre
l’étude des cellules vivantes, alors que la microscopie électronique exige une fixation préalable des cellules, une opération
qui les tue. De plus, la préparation des échantillons risque
d’introduire des artéfacts, c’est-à-dire des altérations ou des
anomalies structurales inexistantes dans les cellules intactes
(ce qui est vrai de toutes les techniques de microscopie).
Ces dernières décennies, des percées techniques majeures
ont donné un second souffle au microscope photonique (voir
la figure 6.3). L’utilisation de marqueurs fluorescents a rendu
possible l’observation de plus en plus détaillée des molécules
et des structures cellulaires individuelles. De plus, la microscopie confocale et la microscopie avec déconvolution ont
donné des images en 3-D beaucoup plus nettes des cellules et
des tissus. Finalement, les dix dernières années ont été marquées par l’introduction d’un ensemble de nouvelles techniques et de nouvelles méthodes de marquage des molécules.
Grâce à ces outils, les chercheurs ont réussi à dépasser la
limite de la résolution et à distinguer des structures subcellulaires dont la taille est d’environ 10 à 20 nm. Avec la propagation de cette « microscopie de super-résolution », ou
nanoscopie, les images de cellules vivantes que nous verrons
pourraient bien nous impressionner autant que celles de
van Leeuwenhoek ont émerveillé Robert Hooke il y a 350 ans.
Les microscopes de tous genres sont les principaux outils
de la cytologie, soit l’étude des structures de la cellule. Cependant, pour comprendre le fonctionnement des structures,
il a fallu intégrer la cytologie et la biochimie, c’est-à-dire
l’étude des molécules et des processus chimiques (métabolisme) des cellules.
Le fractionnement cellulaire
La technique biochimique du fractionnement cellulaire
consiste à décomposer les cellules et à en isoler les principaux
organites et autres structures subcellulaires (figure 6.4). Cette
technique est particulièrement utile pour étudier la structure
et le fonctionnement des cellules. Le fractionnement se fait à
l’aide d’une centrifugeuse, un instrument capable de faire
tourner à des vitesses de plus en plus élevées des éprouvettes
contenant des cellules préalablement dissociées dans un
mélangeur. À chacune de ces vitesses, la force centrifuge produite isole des constituants de la cellule qui se déposent au
fond du tube, formant un culot. Aux vitesses les plus basses,
le précipité est formé des composants les plus gros, et aux
vitesses les plus hautes, des plus petits.
Il est souvent nécessaire de faire suivre la centrifugation différentielle d’une autre centrifugation qui, elle, sépare des
constituants différents contenus dans un même culot, selon
. Figure 6.4
Le fractionnement cellulaire
ApplICAtIon Le fractionnement cellulaire sert à isoler (fractionner) les
constituants de la cellule selon leur taille et leur masse volumique.
teCHnIQue La première étape du fractionnement est l’homogénéisation dans un mélangeur afin de désintégrer les cellules. L’homogénat est
centrifugé, puis le surnageant (liquide) est ensuite versé dans une autre
éprouvette. Il est alors centrifugé plus longtemps à une vitesse plus élevée. On répète le processus à plusieurs reprises. Cette « centrifugation
différentielle » produit une série de culots, chacun contenant un composant cellulaire différent.
Centrifugation
Homogénéisation
Cellules
d’un tissu
Homogénat
Centrifugé
à 1 000 g
(1 000 fois
la force de gravité)
pendant 10 min
20 000 g
Surnageant versé
dans l’éprouvette
suivante
Centrifugation
différentielle
Culot riche
en noyaux et en
débris cellulaires
pendant 20 min
80 000 g
pendant 60 min
150 000 g
pendant 3 h
Culot riche en
mitochondries
(et en chloroplastes,
dans le cas des
cellules végétales)
Culot riche en « microsomes »
(fragments de membranes
plasmiques et de membranes
de l’intérieur de la cellule)
Culot riche
en ribosomes
résultAts Dans les premières expérimentations, les chercheurs ont
utilisé la microscopie pour identifier les organites de chaque culot et des
techniques biochimiques pour déterminer les fonctions métaboliques
de chaque organite. Ces travaux ont établi des valeurs de référence pour
les expériences subséquentes, ce qui a permis aux générations suivantes de
chercheurs de savoir quelle fraction cellulaire ils devaient recueillir pour
isoler et étudier tels ou tels organites.
MéthoDe De recher che
Les électrons qui traversent l’échantillon sont plutôt dispersés
dans les régions plus denses, de sorte que moins d’électrons
sont transmis (ces régions paraissent plus sombres). L’image
révèle la disposition des électrons transmis. Au lieu de comporter des lentilles de verre, le microscope électro nique à transmission fonctionne au moyen d’électroaimants qui mettent
l’image au point et la grossissent en déviant la trajectoire des
électrons. L’image est finalement projetée sur un écran.
Les microscopes électroniques ont permis de découvrir un
grand nombre d’organites et une quantité d’autres structures
subcellulaires invi sibles au microscope photonique. Toutefois, le MP a des avantages, notamment celui de permettre
l’étude des cellules vivantes, alors que la microscopie électronique exige une fixation préalable des cellules, une opération
qui les tue. De plus, la préparation des échantillons risque
d’introduire des artéfacts, c’est-à-dire des altérations ou des
anomalies structurales inexistantes dans les cellules intactes
(ce qui est vrai de toutes les techniques de microscopie).
Ces dernières décennies, des percées techniques majeures
ont donné un second souffle au microscope photonique (voir
la figure 6.3). L’utilisation de marqueurs fluorescents a rendu
possible l’observation de plus en plus détaillée des molécules
et des structures cellulaires individuelles. De plus, la microscopie confocale et la microscopie avec déconvolution ont
donné des images en 3-D beaucoup plus nettes des cellules et
des tissus. Finalement, les dix dernières années ont été marquées par l’introduction d’un ensemble de nouvelles techniques et de nouvelles méthodes de marquage des molécules.
Grâce à ces outils, les chercheurs ont réussi à dépasser la
limite de la résolution et à distinguer des structures subcellulaires dont la taille est d’environ 10 à 20 nm. Avec la propagation de cette « microscopie de super-résolution », ou
nanoscopie, les images de cellules vivantes que nous verrons
pourraient bien nous impressionner autant que celles de
van Leeuwenhoek ont émerveillé Robert Hooke il y a 350 ans.
Les microscopes de tous genres sont les principaux outils
de la cytologie, soit l’étude des structures de la cellule. Cependant, pour comprendre le fonctionnement des structures,
il a fallu intégrer la cytologie et la biochimie, c’est-à-dire
l’étude des molécules et des processus chimiques (métabolisme) des cellules.
Le fractionnement cellulaire
La technique biochimique du fractionnement cellulaire
consiste à décomposer les cellules et à en isoler les principaux
organites et autres structures subcellulaires (figure 6.4). Cette
technique est particulièrement utile pour étudier la structure
et le fonctionnement des cellules. Le fractionnement se fait à
l’aide d’une centrifugeuse, un instrument capable de faire
tourner à des vitesses de plus en plus élevées des éprouvettes
contenant des cellules préalablement dissociées dans un
mélangeur. À chacune de ces vitesses, la force centrifuge produite isole des constituants de la cellule qui se déposent au
fond du tube, formant un culot. Aux vitesses les plus basses,
le précipité est formé des composants les plus gros, et aux
vitesses les plus hautes, des plus petits.
Il est souvent nécessaire de faire suivre la centrifugation différentielle d’une autre centrifugation qui, elle, sépare des
constituants différents contenus dans un même culot, selon
. Figure 6.4
Le fractionnement cellulaire
ApplICAtIon Le fractionnement cellulaire sert à isoler (fractionner) les
constituants de la cellule selon leur taille et leur masse volumique.
teCHnIQue La première étape du fractionnement est l’homogénéisation dans un mélangeur afin de désintégrer les cellules. L’homogénat est
centrifugé, puis le surnageant (liquide) est ensuite versé dans une autre
éprouvette. Il est alors centrifugé plus longtemps à une vitesse plus élevée. On répète le processus à plusieurs reprises. Cette « centrifugation
différentielle » produit une série de culots, chacun contenant un composant cellulaire différent.
Centrifugation
Homogénéisation
Cellules
d’un tissu
Homogénat
Centrifugé
à 1 000 g
(1 000 fois
la force de gravité)
pendant 10 min
20 000 g
Surnageant versé
dans l’éprouvette
suivante
Centrifugation
différentielle
Culot riche
en noyaux et en
débris cellulaires
pendant 20 min
80 000 g
pendant 60 min
150 000 g
pendant 3 h
Culot riche en
mitochondries
(et en chloroplastes,
dans le cas des
cellules végétales)
Culot riche en « microsomes »
(fragments de membranes
plasmiques et de membranes
de l’intérieur de la cellule)
Culot riche
en ribosomes
résultAts Dans les premières expérimentations, les chercheurs ont
utilisé la microscopie pour identifier les organites de chaque culot et des
techniques biochimiques pour déterminer les fonctions métaboliques
de chaque organite. Ces travaux ont établi des valeurs de référence pour
les expériences subséquentes, ce qui a permis aux générations suivantes de
chercheurs de savoir quelle fraction cellulaire ils devaient recueillir pour
isoler et étudier tels ou tels organites.
MéthoDe De recher che