4 – ASPECTS PRATIQUES DES ÉTUDES CINÉTIQUES
Avant d’entamer ce chapitre dans lequel nous discutons de plusieurs aspects
pratiques à considérer lors de la réalisation de mesures cinétiques, il faut noter que
la généralisation de l’utilisation de micro-ordinateurs dans les laboratoires à la fin
des années 1980 a modifié considérablement les pratiques de l’étude cinétique.
Le calcul assisté par ordinateur permet, entre autres, de traiter plus rapidement les
données brutes et permet de réaliser des ajustements de paramètres avec des
équations linéaires ou non-linéaires. Alors que l’ajustement manuel du décours
complet d’une réaction sur l’équation intégrée de MICHAELIS et MENTEN est
quasiment impossible, cette procédure peut être réalisée aussi facilement qu’une
régression linéaire avec l’aide d’un ordinateur. Cette évolution des méthodes
d’analyse permet d’utiliser des approches expérimentales qui avaient été négligées
à cause de leurs difficultés d’application.
4.1. MESURE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.1.1. Méthodes continues et discontinues de mesure
La caractérisation des systèmes enzymatiques repose sur la mesure de l’activité
enzymatique et donc sur l’existence d’une méthode expérimentale permettant de
suivre l’évolution de la réaction au cours du temps. Quelle que soit la méthode
analytique choisie, elle doit permettre de distinguer les substrats des produits et de
mesurer leur concentration de manière quantitative. Parmi les méthodes de mesure
utilisées, on distingue les méthodes continues et les méthodes discontinues. Dans
une méthode discontinue, des échantillons sont prélevés du mélange réactionnel à
intervalles successifs et sont analysés indépendamment afin de suivre l’avancement
de la réaction. Lorsque cela est possible, il est toujours préférable néanmoins d’utiliser une méthode continue de mesure dans laquelle l’avancement de la réaction
peut être suivi en continu avec un appareil de mesure automatique. Par exemple,
pour les réactions qui s’accompagnent d’un changement d’absorbance à une
longueur d’onde facilement mesurable, la cinétique peut être suivie à l’aide d’un
spectrophotomètre (JOHN, 2002). Ainsi, de nombreuses réactions biochimiques
impliquant la conversion entre le NAD ox et le NAD red peuvent être aisément suivies
en mesurant la variation d’absorbance à 340 nm. Dans les cas où une méthode
Avant d’entamer ce chapitre dans lequel nous discutons de plusieurs aspects
pratiques à considérer lors de la réalisation de mesures cinétiques, il faut noter que
la généralisation de l’utilisation de micro-ordinateurs dans les laboratoires à la fin
des années 1980 a modifié considérablement les pratiques de l’étude cinétique.
Le calcul assisté par ordinateur permet, entre autres, de traiter plus rapidement les
données brutes et permet de réaliser des ajustements de paramètres avec des
équations linéaires ou non-linéaires. Alors que l’ajustement manuel du décours
complet d’une réaction sur l’équation intégrée de MICHAELIS et MENTEN est
quasiment impossible, cette procédure peut être réalisée aussi facilement qu’une
régression linéaire avec l’aide d’un ordinateur. Cette évolution des méthodes
d’analyse permet d’utiliser des approches expérimentales qui avaient été négligées
à cause de leurs difficultés d’application.
4.1. MESURE DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE
4.1.1. Méthodes continues et discontinues de mesure
La caractérisation des systèmes enzymatiques repose sur la mesure de l’activité
enzymatique et donc sur l’existence d’une méthode expérimentale permettant de
suivre l’évolution de la réaction au cours du temps. Quelle que soit la méthode
analytique choisie, elle doit permettre de distinguer les substrats des produits et de
mesurer leur concentration de manière quantitative. Parmi les méthodes de mesure
utilisées, on distingue les méthodes continues et les méthodes discontinues. Dans
une méthode discontinue, des échantillons sont prélevés du mélange réactionnel à
intervalles successifs et sont analysés indépendamment afin de suivre l’avancement
de la réaction. Lorsque cela est possible, il est toujours préférable néanmoins d’utiliser une méthode continue de mesure dans laquelle l’avancement de la réaction
peut être suivi en continu avec un appareil de mesure automatique. Par exemple,
pour les réactions qui s’accompagnent d’un changement d’absorbance à une
longueur d’onde facilement mesurable, la cinétique peut être suivie à l’aide d’un
spectrophotomètre (JOHN, 2002). Ainsi, de nombreuses réactions biochimiques
impliquant la conversion entre le NAD ox et le NAD red peuvent être aisément suivies
en mesurant la variation d’absorbance à 340 nm. Dans les cas où une méthode