Chapitre II
Matériel et méthodes
31
II.6.1.Coloration de GRAM :
La coloration de Gram permet de déterminer deux grands groupes bactériens (Gram positif et
Gram négatif), elle nous permet aussi de reconnaitre la morphologie et le mode de regroupement
des bactéries, les étapes de la méthode sont comme suit (Joffin et Leyral 2006) :
• Préparation du frottis bactérien : Prélever une jeune colonie bactérienne (de 18-24h) à
identifier et l’étaler sur une goutte d’eau physiologique à l’aide d’une anse de platine puis la
fixer par simple passage sur la flamme du bec bensun.
• Coloration au Violet de Gentiane: Chaque frottis fixé est coloré pendant une minute au
Violet de Gentiane puis laver à l’eau courante.
• Mordançage : Traiter durant une minute à une minute et demi la lame par une solution de
Lugol, puis laver à l’eau courante.
• Décoloration: Faire couler l’alcool
durant 10 secondes sur la lame puis laver
immédiatement à l’eau courante. À ce stade les cellules à Gram négatif seront incolores, les
cellules à Gram positif restent violettes.
• Recoloration: en rajoutant de la fuchsine pendant 1 min, puis rincer et sécher la lame.
➢ Lecture : Examiner le frottis au microscope optique en ajouter une goutte de l'huile à
immersion (au Gx100). Les bactéries à Gram positif sont colorées en violet alors que les
bactéries à Gram négatif sont colorées en rose. Celles-ci diffèrent de part la composition de
leur paroi, notamment par l’épaisseur du peptidoglycane ou de la présence d’une paroi
externe. Cette coloration nous permet également de définir la forme et l’arrangement des
cellules bactériennes.
II.6.2.Identification biochimique des bacilles à Gram négatif :
Après confirmation du GRAM, les souches à GRAM négatif de forme bacille ou cocobacille
ont été identifiées au moyen de galerie API20E. (bioMérieux, Inc. France)
API 20 E est un système standardisé pour l'identification des Enterobacteriaceae et autres
bacilles à Gram négatif non fastidieux, comprenant 21 tests biochimiques miniaturisés, ainsi
qu'une base de données. La galerie API 20 E comporte 20 microtubes contenant des substrats
déshydratés. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les
tests. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages
colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.
Matériel et méthodes
31
II.6.1.Coloration de GRAM :
La coloration de Gram permet de déterminer deux grands groupes bactériens (Gram positif et
Gram négatif), elle nous permet aussi de reconnaitre la morphologie et le mode de regroupement
des bactéries, les étapes de la méthode sont comme suit (Joffin et Leyral 2006) :
• Préparation du frottis bactérien : Prélever une jeune colonie bactérienne (de 18-24h) à
identifier et l’étaler sur une goutte d’eau physiologique à l’aide d’une anse de platine puis la
fixer par simple passage sur la flamme du bec bensun.
• Coloration au Violet de Gentiane: Chaque frottis fixé est coloré pendant une minute au
Violet de Gentiane puis laver à l’eau courante.
• Mordançage : Traiter durant une minute à une minute et demi la lame par une solution de
Lugol, puis laver à l’eau courante.
• Décoloration: Faire couler l’alcool
durant 10 secondes sur la lame puis laver
immédiatement à l’eau courante. À ce stade les cellules à Gram négatif seront incolores, les
cellules à Gram positif restent violettes.
• Recoloration: en rajoutant de la fuchsine pendant 1 min, puis rincer et sécher la lame.
➢ Lecture : Examiner le frottis au microscope optique en ajouter une goutte de l'huile à
immersion (au Gx100). Les bactéries à Gram positif sont colorées en violet alors que les
bactéries à Gram négatif sont colorées en rose. Celles-ci diffèrent de part la composition de
leur paroi, notamment par l’épaisseur du peptidoglycane ou de la présence d’une paroi
externe. Cette coloration nous permet également de définir la forme et l’arrangement des
cellules bactériennes.
II.6.2.Identification biochimique des bacilles à Gram négatif :
Après confirmation du GRAM, les souches à GRAM négatif de forme bacille ou cocobacille
ont été identifiées au moyen de galerie API20E. (bioMérieux, Inc. France)
API 20 E est un système standardisé pour l'identification des Enterobacteriaceae et autres
bacilles à Gram négatif non fastidieux, comprenant 21 tests biochimiques miniaturisés, ainsi
qu'une base de données. La galerie API 20 E comporte 20 microtubes contenant des substrats
déshydratés. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les
tests. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages
colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.