Annexes
Pour estimer l’absorbance due à la turbidité, on passe le même échantillon au spectrophotomètre mais
à 750 nm (longueur d’onde à laquelle absorbent les fibres du filtre). Les dérivés de la Chl-a sont
susceptibles d’induire une erreur énorme, car ils absorbent presque à la même longueur d’onde
caractéristique de la chlorophylle (~665nm) ; la solution sera donc d’acidifier l’échantillon par
quelques gouttes d’acide chlorhydrique (HCl 0,3N) pendant 2 à 5 minutes pour décomposer la totalité
des pigments chlorophylliens en phéopigments. Ensuite, on mesure l’absorbance aux deux longueurs
d’onde précédemment décrites.
Mode opératoire
• Lancer le logiciel pour le spectrophotomètre JASCO V-730.
• Fixer les deux longueurs d’onde auxquelles on effectue la mesure 665 nm et 750 nm.
• Dans une cuve, verser 3 ml environ d’acétone, puis tarer l’appareil en appuyant sur l’icône «
Auto zéro », pour ne pas prendre en considération, lors de la mesure, l’absorbance due au
solvant ainsi de la cuve elle-même.
• Rincer la cuve une fois avec un peu de l'extrait à analyser.
• Transférer dans la cuve assez de volume pour faire la mesure.
• Vérifier la propreté des faces de la cuve et la positionner correctement sur le portoir.
• Mesurer les absorbances brutes de l'extrait non acidifié aux longueurs d'ondes de 665 et 750
nm, en appuyant sur l’icône « Sample ».
• Sortir la cuve et ajouter l'acide chlorhydrique 0,3 N à raison de 10 à 20 μl par millilitre
d'extrait.
• Laisser agir l'acide entre 2 et 5 min (mais pas plus).
• Mesurer à nouveau les absorbances brutes des extraits acidifiés à 665 et 750 nm.
• Rincer plusieurs fois la cuve au solvant pour éliminer toute trace d'acidité de l'échantillon
précédent, et faire la même chose pour les autres échantillons.
Le calcul de la concentration finale de la Chl-a est effectué suivant les formules décrite dans (Aminot
& Kérouel, 2004):
Avant acidification : Abs éch-665
NA
= Abs 665 −Abs 750
(1)
Après acidification : Abs éch-665
A
= Abs 665 −Abs 750
(2)
Après avoir corrigé l’absorbance, on peut déduire aisément la concentration de la Chl-a dans
l’échantillon prélevé en appliquant la formule suivante :
Chla = 27.7∗(Abs éch-665
NA
−Abs éch-665
A
) ∗
v
V ∗l
(3)
V: volume d'eau filtrée (litre).
v: volume de solvant d'extraction (ml).
l: longueur du trajet optique de la cuve de mesure (centimètre).
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Pour estimer l’absorbance due à la turbidité, on passe le même échantillon au spectrophotomètre mais
à 750 nm (longueur d’onde à laquelle absorbent les fibres du filtre). Les dérivés de la Chl-a sont
susceptibles d’induire une erreur énorme, car ils absorbent presque à la même longueur d’onde
caractéristique de la chlorophylle (~665nm) ; la solution sera donc d’acidifier l’échantillon par
quelques gouttes d’acide chlorhydrique (HCl 0,3N) pendant 2 à 5 minutes pour décomposer la totalité
des pigments chlorophylliens en phéopigments. Ensuite, on mesure l’absorbance aux deux longueurs
d’onde précédemment décrites.
Mode opératoire
• Lancer le logiciel pour le spectrophotomètre JASCO V-730.
• Fixer les deux longueurs d’onde auxquelles on effectue la mesure 665 nm et 750 nm.
• Dans une cuve, verser 3 ml environ d’acétone, puis tarer l’appareil en appuyant sur l’icône «
Auto zéro », pour ne pas prendre en considération, lors de la mesure, l’absorbance due au
solvant ainsi de la cuve elle-même.
• Rincer la cuve une fois avec un peu de l'extrait à analyser.
• Transférer dans la cuve assez de volume pour faire la mesure.
• Vérifier la propreté des faces de la cuve et la positionner correctement sur le portoir.
• Mesurer les absorbances brutes de l'extrait non acidifié aux longueurs d'ondes de 665 et 750
nm, en appuyant sur l’icône « Sample ».
• Sortir la cuve et ajouter l'acide chlorhydrique 0,3 N à raison de 10 à 20 μl par millilitre
d'extrait.
• Laisser agir l'acide entre 2 et 5 min (mais pas plus).
• Mesurer à nouveau les absorbances brutes des extraits acidifiés à 665 et 750 nm.
• Rincer plusieurs fois la cuve au solvant pour éliminer toute trace d'acidité de l'échantillon
précédent, et faire la même chose pour les autres échantillons.
Le calcul de la concentration finale de la Chl-a est effectué suivant les formules décrite dans (Aminot
& Kérouel, 2004):
Avant acidification : Abs éch-665
NA
= Abs 665 −Abs 750
(1)
Après acidification : Abs éch-665
A
= Abs 665 −Abs 750
(2)
Après avoir corrigé l’absorbance, on peut déduire aisément la concentration de la Chl-a dans
l’échantillon prélevé en appliquant la formule suivante :
Chla = 27.7∗(Abs éch-665
NA
−Abs éch-665
A
) ∗
v
V ∗l
(3)
V: volume d'eau filtrée (litre).
v: volume de solvant d'extraction (ml).
l: longueur du trajet optique de la cuve de mesure (centimètre).
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