Annexes
• Verser l'échantillon dans l’entonnoir, appliquer le vide et s'assurer que la dépression n'est pas
excessive (0,2 bar).
• Juste avant que le filtre ne vienne à sec, rincer les parois de l’entonnoir avec un peu d'eau
distillée pour éviter les pertes en pigments.
• Après assèchement du filtre, laisser fluer l'air quelques instants pour éliminer l'eau du filtre.
• Si l'échantillon n'a pas été pré-filtré, éliminer à la pince, si nécessaire, le zooplancton visible à
l'œil nu sur le filtre.
• A l’aide de deux pinces, plier le filtre une première fois, face chargée à l'intérieur, plier une
seconde fois le filtre et l'introduire dans le tube pour l’extraction.
• Si une extraction immédiate n’est pas possible, envelopper le tube avec une feuille
d’aluminium pour le conserver au congélateur à -20°C.
1.2. Extraction des pigments
Pour l’extraction on utilise l’acétone comme un solvant d’extraction (recommandé par Aminot and
Kérouel, (2004)), comme suit :
• Introduire le filtre plié dans le tube à centrifuger, ajouter 5 ml (±0,4) de l’acétone (dans un
premier temps) pour éviter le débordement du solvant.
• Déchiqueter le filtre à l’aide d’une baguette en verre et bien agiter, ceci aide à disperser les
fibres dans le milieu.
• Rajouter les 5 ml (±0,4) restants du solvant, boucher le tube, pour éviter une volatilisation
éventuelle de l’acétone.
• Laisser agir une nuit au réfrigérateur.
1.3. Centrifugation
Cette étape concerne la séparation de la fraction lourde (fragments du filtre) de la fraction légère (la
chlorophylle ainsi que ses dérivés). Pour cela, nous avons utilisé la centrifugeuse SIGMA 2-6. Le
surnageant est récupéré à l’aide d’une micro-pipette.
• Placer les tubes dans la centrifugeuse, tout en gardant l’équilibre du rotor.
• Fixer la centrifugeuse à 3500 tour/minute et centrifuger pendant 5 minutes environ.
• Après les premières cinq minutes, retirer les tubes pour remettre en suspension les fibres
plaquées contre les parois des tubes.
• Refaire une deuxième centrifugation qui peut aller jusqu’à 10 à 15 minutes à la même vitesse.
1.4. Analyse par spectrophotomètre
Juste après la centrifugation, transférer le surnageant de centrifugation dans la cuve de mesure en le
prélevant par aspiration lente, en veillant à ne pas prendre les fibres avec, puis, on mesure l’absorbance
à 665 nm (longueur d’onde caractéristique de la Chl-a) à l’aide du spectrophotomètre JASCO V-730.
L’absorbance mesurée par le spectrophotomètre est due à plusieurs composants : le solvant, la
chlorophylle, les phéopigments et les fibres du filtre, d’où la nécessité de corriger l’absorbance par
rapport à toutes ces interférences.
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• Verser l'échantillon dans l’entonnoir, appliquer le vide et s'assurer que la dépression n'est pas
excessive (0,2 bar).
• Juste avant que le filtre ne vienne à sec, rincer les parois de l’entonnoir avec un peu d'eau
distillée pour éviter les pertes en pigments.
• Après assèchement du filtre, laisser fluer l'air quelques instants pour éliminer l'eau du filtre.
• Si l'échantillon n'a pas été pré-filtré, éliminer à la pince, si nécessaire, le zooplancton visible à
l'œil nu sur le filtre.
• A l’aide de deux pinces, plier le filtre une première fois, face chargée à l'intérieur, plier une
seconde fois le filtre et l'introduire dans le tube pour l’extraction.
• Si une extraction immédiate n’est pas possible, envelopper le tube avec une feuille
d’aluminium pour le conserver au congélateur à -20°C.
1.2. Extraction des pigments
Pour l’extraction on utilise l’acétone comme un solvant d’extraction (recommandé par Aminot and
Kérouel, (2004)), comme suit :
• Introduire le filtre plié dans le tube à centrifuger, ajouter 5 ml (±0,4) de l’acétone (dans un
premier temps) pour éviter le débordement du solvant.
• Déchiqueter le filtre à l’aide d’une baguette en verre et bien agiter, ceci aide à disperser les
fibres dans le milieu.
• Rajouter les 5 ml (±0,4) restants du solvant, boucher le tube, pour éviter une volatilisation
éventuelle de l’acétone.
• Laisser agir une nuit au réfrigérateur.
1.3. Centrifugation
Cette étape concerne la séparation de la fraction lourde (fragments du filtre) de la fraction légère (la
chlorophylle ainsi que ses dérivés). Pour cela, nous avons utilisé la centrifugeuse SIGMA 2-6. Le
surnageant est récupéré à l’aide d’une micro-pipette.
• Placer les tubes dans la centrifugeuse, tout en gardant l’équilibre du rotor.
• Fixer la centrifugeuse à 3500 tour/minute et centrifuger pendant 5 minutes environ.
• Après les premières cinq minutes, retirer les tubes pour remettre en suspension les fibres
plaquées contre les parois des tubes.
• Refaire une deuxième centrifugation qui peut aller jusqu’à 10 à 15 minutes à la même vitesse.
1.4. Analyse par spectrophotomètre
Juste après la centrifugation, transférer le surnageant de centrifugation dans la cuve de mesure en le
prélevant par aspiration lente, en veillant à ne pas prendre les fibres avec, puis, on mesure l’absorbance
à 665 nm (longueur d’onde caractéristique de la Chl-a) à l’aide du spectrophotomètre JASCO V-730.
L’absorbance mesurée par le spectrophotomètre est due à plusieurs composants : le solvant, la
chlorophylle, les phéopigments et les fibres du filtre, d’où la nécessité de corriger l’absorbance par
rapport à toutes ces interférences.
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