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5 • Techniques et biotechnologies
5.3.2 Transfections
Le terme de transfection est généralement réservé aux transferts géniques faits in vitro dans des cultures cellulaires. Il y a plusieurs manières
de transfecter une cellule, la plus élémentaire consistant à micro-injecter
avec une seringue la construction intéressante. Habituellement on a
recours à des techniques plus productives : précipitation de l’ADN par
du phosphate de calcium pour pénétrer la barrière membranaire, le
DEAE-Dextran agit de la même façon, l’électroporation consiste à perméabiliser la membrane cellulaire au moyen d’impulsions électriques à
haute tension 1 , on peut enfin projeter par « bombardement » des microparticules revêtues. La liste est importante.
D’autres modes de transfection utilisent les rétrovirus comme vecteurs. Ils permettent des constructions stables, encore faut-il inactiver
les virus et leur donner la capacité d’exprimer la séquence d’intérêt.
Ces virus ne peuvent s’incorporer dans l’ADN-hôte que s’ils restent
d’une longueur relativement constante, il faut donc avant d’incorporer
la séquence nucléotidique que l’on veut étudier supprimer par délétion
certaines des séquences déjà existantes, mais comme ces séquences servent à la multiplication des virus il faudra les réintroduire à part sous
forme d’« helper ». Le virus vecteur pourra se développer et s’amplifier
dans la cellule-hôte, et ensuite transfecter la préparation qui nous intéresse. On peut aussi utiliser le virus à ADN SV40 qui est un virus du
singe capable d’induire des cancers chez le rongeur mais pas chez l’homme
ou des adénovirus. Il y a aussi possibilité de transférer des gènes en utilisant des vecteurs plus « naturels » comme les lymphocytes eux-mêmes.
Qui dit transfection dit préparation et manipulation du matériel
génétique qui sera transfecté (le discours sera plus loin le même pour
les transferts sur animal entier). On peut créer des délétions (fig. 53),
c’est-à-dire supprimer une séquence en utilisant la carte de restriction
et en supprimant un segment compris entre deux sites de restriction.
1. En utilisant par exemple 3 trains de 100 impulsions de 100 µs à 50 mA chacun
fournies par un électropulser type GET42 (www.elecinfopilat.com), ce qui donne
un ordre de grandeur.
5 • Techniques et biotechnologies
5.3.2 Transfections
Le terme de transfection est généralement réservé aux transferts géniques faits in vitro dans des cultures cellulaires. Il y a plusieurs manières
de transfecter une cellule, la plus élémentaire consistant à micro-injecter
avec une seringue la construction intéressante. Habituellement on a
recours à des techniques plus productives : précipitation de l’ADN par
du phosphate de calcium pour pénétrer la barrière membranaire, le
DEAE-Dextran agit de la même façon, l’électroporation consiste à perméabiliser la membrane cellulaire au moyen d’impulsions électriques à
haute tension 1 , on peut enfin projeter par « bombardement » des microparticules revêtues. La liste est importante.
D’autres modes de transfection utilisent les rétrovirus comme vecteurs. Ils permettent des constructions stables, encore faut-il inactiver
les virus et leur donner la capacité d’exprimer la séquence d’intérêt.
Ces virus ne peuvent s’incorporer dans l’ADN-hôte que s’ils restent
d’une longueur relativement constante, il faut donc avant d’incorporer
la séquence nucléotidique que l’on veut étudier supprimer par délétion
certaines des séquences déjà existantes, mais comme ces séquences servent à la multiplication des virus il faudra les réintroduire à part sous
forme d’« helper ». Le virus vecteur pourra se développer et s’amplifier
dans la cellule-hôte, et ensuite transfecter la préparation qui nous intéresse. On peut aussi utiliser le virus à ADN SV40 qui est un virus du
singe capable d’induire des cancers chez le rongeur mais pas chez l’homme
ou des adénovirus. Il y a aussi possibilité de transférer des gènes en utilisant des vecteurs plus « naturels » comme les lymphocytes eux-mêmes.
Qui dit transfection dit préparation et manipulation du matériel
génétique qui sera transfecté (le discours sera plus loin le même pour
les transferts sur animal entier). On peut créer des délétions (fig. 53),
c’est-à-dire supprimer une séquence en utilisant la carte de restriction
et en supprimant un segment compris entre deux sites de restriction.
1. En utilisant par exemple 3 trains de 100 impulsions de 100 µs à 50 mA chacun
fournies par un électropulser type GET42 (www.elecinfopilat.com), ce qui donne
un ordre de grandeur.